In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärkultur Einstellung ermöglicht die Identifizierung von konservierten und unterschiedliche Regulationsmechanismen ganzen die Wirbellinien.
Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten und Zeit mit dem Studium der myogenen Programm in vivo beteiligt, Primärkultursysteme von den ansässigen adulten Stammzellen der Skelettmuskulatur abgeleitet, die myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sind unverzichtbar für unser Verständnis von Säugetierskelettmuskelentwicklung bewährt und Wachstum. Besonders bei den basalen Taxa der Wirbeltiere sind jedoch begrenzt, die molekularen Mechanismen, die die Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung von MPC Beschreibung von Daten. Von besonderem Interesse sind mögliche Mechanismen, die die Fähigkeit der basalen Wirbeltieren zu erheblichen postlarvalen Skelett myofiber Hyperplasie (dh Knochenfische) und die vollständige Regeneration nach Anhängsel Verlust (dh urodele Amphibien) zu unterziehen zugrunde liegen. Zusätzlich könnte die Verwendung von kultivierten Myoblasten im Verständnis der Regeneration und der Wiederholung des myogenen Programm und die Unterschiede zwischen ihnen zu unterstützen. ZuZu diesem Zweck beschreiben wir im Detail ein robustes und effizientes Protokoll (und Variationen) für die Isolierung und die Aufrechterhaltung MPCs und ihre Nachkommen, Myoblasten und Myotuben unreifen, in der Zellkultur als Plattform für das Verständnis der Evolution des myogenen Programm, beginnend mit dem mehr basalen Wirbeltieren. Aufbauend auf der Modellorganismus Status der Zebrafisch (Danio rerio) berichten wir über die Anwendung dieses Protokolls auf kleine Fische des Cyprinidengewässer Clade Danioninae. Parallel kann dieses Protokoll genutzt werden, um eine breitere vergleichenden Ansatz durch Isolierung MPCs aus dem mexikanischen Axolotl (Ambystomamexicanum) und sogar Labornagern zu verwirklichen. Dieses Protokoll wird heute weitgehend in Studium myogenesis in mehreren Fischarten, darunter die Regenbogenforelle, Lachs und Meerbrassen 4.1 verwendet.
Erhebliche Verständnis von Säugetier myogenesis hat durch die Wiederholung dieses Prozesses sowohl in primären Maus (Mus musculus) Myoblasten-Kulturen und die gut beschriebene Maus-abgeleitete Zelllinie gewonnen wurden, C2C12 5. Beginnend in den 1950er Jahren 6, diese Kulturen haben viel Fortschritt im Verständnis der murinemyogenic Programm durch die Erweiterung, myogenesis in anderen Wirbeltieren führte, und. Zusätzlich einzelnen Zelle myofiber Explantat Techniken haben das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Satelliten Muskelfasern 7-9 für Untersuchungen myogenesis besonders attraktiv aufgrund der kurzen Zeit von Vorläuferzelle 10 zu unterscheiden, der relativen Leichtigkeit der Transfektion für RNAi erhöht. Zellkulturen 11-14, transgene 15,16 und Überexpression Studien 14,17,18, in-vitro-Expansion, gefolgt von In-vivo-Transplantation 18-20, und sogar Layoutarison myogener Vorläuferzellen und deren Regel Agenten in Taxa 21,22. Während die Unterschiede aufgrund der künstlichen Umgebung des Kultursystems beschrieben worden, 5,23, haben diese in vitro-Systemen nachgewiesen unverzichtbar für unser Dissektion der komplizierten Programm für die Bildung von vielkernigen sein, mononukleären terminal differenzierten myofibersfrom proliferative Vorläuferzellen bekannt myosatellite Zellen (MSC) unter den Säugetieren.
Außerhalb der Klasse Mammalia jedoch die Erhaltung und / oder Divergenz der Mechanismen, die myogenesis schlecht verstanden werden, vor allem wegen der Schwierigkeiten bei der Kultivierung von myogenen Vorläuferzellen (MPCs) und Myoblasten aus verschiedenen Taxa. Tatsächlich haben die Grund Myoblastenkulturen nur in drei Vögel 24-26, ein Reptil 27, ein paar Amphibien 28-30, und einige Fische 1,3,4,31-33 beschrieben. Kontinuierliche myogenen Zelllinien aus veandere als Nagetiere 34-36 rtebrates sind noch seltener, nur mit dem Nicht-Säuger myogenen Zelllinie, die aus der japanischen Wachtel (Cortunix japonica) abgeleitet, QM7 37. Trotz vieler Versuche der Verewigung, bleibt ein Knochenfisch myogenen Zelllinie schwer zu fassen und ein Protokoll für die effiziente Transfektion dieser Zellen wurde erst in diesem Jahr 15 veröffentlicht. So sind klar und gut optimierte Protokolle für die Kultivierung von primären Myoblasten MPCs und aus einer Vielzahl von Wirbeltieren sehr notwendig, um nicht nur weiter unser Wissen über die Evolution des myogenen Programm zu erweitern, aber die Macht der vergleichenden Physiologie beschäftigen, um Durchbrüche in machen die Behandlung von menschlichen Skelettmuskelerkrankungen und Störungen.
Während die Literatur enthält viele Berichte von MPC / Myoblasten Isolierung 38-49, ist es üblich, dass Autoren, die Protokolle für solche Trennungen in kurzen, oft unvollständig, Formate zu beschreiben. Ferner sind die lehrreichsten Protokolle RepoRTED haben für Mäuse von 50 bis 53 entwickelt, und einige von diesen setzen auf Antikörperselektion 54,55 oder Fluoreszenz Transgene 56,57, so dass diese Protokolle unbrauchbar oder unpraktisch durch Muskel Biologen genutzt innersten Nicht-Nagetieren. Mit wenig über piscine-, Amphibien-, Reptilien-und Myogenese eine detaillierte und gründliche Protokoll, mit audiovisuellen Führung und mit nachgewiesener Effizienz in entfernt verwandten Arten beschrieben, wäre sehr hilfreich, um das Feld ein.
Zuerst von Powell und Kollegen im Jahr 1989 58 beschrieben, wurde das folgende Protokoll ursprünglich entwickelt, um PLM und Myoblasten aus Salmonidfischen (nämlich, Regenbogenforelle, Oncorhynchus mykiss und Atlantischer Lachs, Salmo salar) und einigen größeren Karpfenfischen (dh Goldfisch, Carassiusauratusauratus) zu isolieren . Im Jahr 2000 Fauconneau Paboeuf und optimiert eine primäre Myoblastenkultur für Regenbogenforelle 59 und minoroptimizations made dieses Protokoll nutzbar in mehrere kleinere Elritzen der Danioninae Clade (Zebrafisch, Danio rerio, und riesige Danio, Devario aequipinnatus) 32 aufgrund der vielen genetischen Werkzeuge für die Zebrafisch-Arbeit zur Verfügung und damit seine nahen Verwandten. Knochenfische sind attraktiv für Organismen Studie aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsstrategie (zumindest in den meisten Arten). Große Salmoniden, wie die meisten Fische, unbestimmt wachsen, mit Wachstumspotenzial durch eine Asymptote bei Fälligkeit uneingeschränkten, auch im Alter 60-62. Anders als Zebrafisch, große danionins wie der riesige Danio 63 und Schnurrbart danio Display Wachstum typisch für Knochenfische Potenziale, die ihre direkten Gegenüberstellung zu einer idealen Plattform für das Verständnis, ob MPC Zellschicksal Wahl spielt eine Rolle im Skelettmuskel-Hypertrophie-Hyperplasie gegenüber.
Ebenso haben wir gezeigt, dass dieses Protokoll mit Mäusen und axolotls verwendet werden, wobei relativ hohe Zellausbeute und VIABility Indizes. Urodele Salamander, wie der mexikanische Axolotl (Ambystomamexicanum), besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, Gewebe zu regenerieren, einschließlich ganzer Gliedmaßen und Schwänze 64-66. Diese Eigenschaft macht diese Amphibien interessante Modelle der Skelettmuskelabbau und Alterung. Mit dem unten beschriebenen Protokoll kann ein ähnlicher Ansatz durchgeführt werden, wie es in vielen Fischarten durchgeführt worden, die eine noch breitere Vergleichs Rahmen für solche Studien. Wie viele wirklich Vergleichs Biologen schätzen, die am sinnvollsten Fortschritte in der Grundlagen der Biologie und translationale Biomedizin ist möglich, wenn Daten innerhalb der breitesten Spektrum analysiert (hier der gesamte Wirbel Linie) werden.
Myogenen Programms in welcher suchten Spezies, kann am einfachsten durch eine in-vitro-System untersucht werden. In der Tat, nach der Isolierung, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) in Fisch oder myosatellite Zellen (MSC) in Säugetieren geben Sie einfach dieses stark regulierten Prozess, der die Proliferation, Zellzyklus-Entzug, und die terminale Differenzierung von Myoblasten und die Fusion von Myoblasten in diesen entstehenden Myotuben. Der allgemeine Mangel an transgenen Reportergens Stämme piscine Arten (mit…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei vielen Dank an Dr. verlängern. Josep Planas und Juan Castillo für ihre berufliche Expertise in der Entwicklung und Anwendung dieser Kultur-Protokoll, um kleine Fische und Amphibien. Dank gebührt auch den zahllosen Menschen, die unermüdlich mit der Dissektion und Dissoziation von Muskelgewebe von vielen Fischen (sowohl in Art und Zahl), darunter Matthew Lade, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall unterstützt haben, Ben Meyer, Ethan Remily und Sinibaldo Romero. Diese Arbeit wurde von der University of Alabama in Birmingham Fachbereich Biologie Start-up-Fonds, Zentrum für Protease Forschung NIH # 2P20 RR015566, NIH Grants NIAMS # R03AR055350 NDSU Advance-FORWARD NSF Zuschuss # HRD-0811239 zu PRB unterstützt und. Unterstützung wurde auch von der UAB Nutrition Obesity Research Center Auszeichnung # P30DK056336, NIH NIDDK vorgesehen. Sein Inhalt sind allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingtdie offizielle Meinung des NIH.
Table 1. Detailed Reagent Information | ||||
Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture | |
γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg | |
DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L | |
Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g | |
HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g | |
Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL | |
Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL | |
Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL | |
Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL | |
Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g | |
Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g | |
Table 2. Consumables, Tools and Equipment | ||||
Consumable | Tools | Equipment | ||
Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | ||
Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | ||
Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | ||
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | ||
Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | ||
Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | ||
12-16 G Cannulas with Luer Locks | ||||
Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** | |
6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 | |
24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 | |
48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 | |
96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 | |
*0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | |||
Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | ||||
Reagent | Isolation | Wash | Dissociation | Complete |
Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL | 178.00 mL |
PSF* | 5.00 mL | 4.00 mL | 3.00 mL | 2.00 mL |
Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | – | – |
Donor Equine Serum | 75.00 mL | – | – | – |
Fetal Bovine Serum*** | – | – | – | 20.00 mL |
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | ||||
Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume | |
6 well | 9.5 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 1 mL | |
24 well | 1.9 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 250 μL | |
48 well | 0.95 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 150 μL | |
96 well | 0.32 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 50-100 μL | |
Table 6. Average number of cells per g tissue | ||||
Species | Average # cells/g tissue | |||
Danio rerio | 6,400,000 | |||
Danio dangila | 1,783,000 | |||
Devario aequipinnatus | 1,797,000 | |||
Oncorhynchus mykiss | 66,800 | |||
Table 7. Recommended Incubation Temperatures | ||||
Species | Temperature | |||
Danio/ Devario spp. | 26 – 28 °C | |||
Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* – 18 °C | |||
Ambystoma mexicanum | 18°C | |||
* Lower temperatures support lower proliferation rates. |