A cultura in vitro sistemas provaram indispensável para a nossa compreensão de myogenesis vertebrados. No entanto, ainda há muito a ser aprendido sobre o desenvolvimento do músculo esquelético não Mamífero e crescimento, particularmente na taxa basal. De uma forma eficiente e robusta para isolar as células estaminais de adultos deste tecido, as células precursoras miogénicos (PPM), e manter a sua auto-renovação, a proliferação e diferenciação de uma configuração de cultura primária permite a identificação de mecanismos reguladores conservadas e divergentes ao longo as linhagens de vertebrados.
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Artigo de método
Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens
Neste artigo
Resumo
Resumo
Devido à dificuldade e tempo inerente envolvido com o estudo do programa miogênica in vivo, sistemas de cultura primários derivados das células-tronco adultas residentes do músculo esquelético, as células precursoras miogênicas (PPM), têm se mostrado indispensável para a nossa compreensão do desenvolvimento do músculo esquelético de mamíferos e crescimento. Particularmente entre a taxa basal de vertebrados, no entanto, os dados são limitados descrevendo os mecanismos moleculares que controlam a auto-renovação, a proliferação e diferenciação de PPM. De particular interesse são potenciais mecanismos que estão na base da capacidade de vertebrados basais a sofrer considerável postlarval esquelético myofiber hiperplasia (ou seja, peixes teleósteos) e regeneração completa após perda apêndice (ou seja Urodelos anfíbios). Além disso, o uso de mioblastos em cultura pode ajudar na compreensão da regeneração e da recapitulação do programa miogénica e as diferenças entre eles. Paraeste fim, que descrevem em pormenor um protocolo robusto e eficiente (e variações neles) para isolar e manter PPM e sua descendência, mioblastos e de miotubos imaturas, em cultura celular, como uma plataforma para a compreensão da evolução do programa miogénica, começando com o mais vertebrados basais. Capitalizando sobre o status organismo modelo do peixe-zebra (Danio rerio), relatamos a aplicação deste protocolo a pequenos peixes do clado ciprinídeo Danioninae. Em paralelo, este protocolo pode ser utilizado para realizar uma abordagem comparativa mais ampla, isolando PPM do axolotl mexicano (Ambystomamexicanum) e até mesmo roedores de laboratório. Este protocolo é agora amplamente utilizados no estudo myogenesis em várias espécies de peixes, incluindo a truta arco-íris, salmão e besugo 1-4.
Introdução
Compreensão considerável de myogenesis mamíferos foi obtida através da recapitulação do processo em ambos os rato primária (Mus musculus) culturas de mioblastos ea linha celular derivada de rato bem descrita, C2C12 5. Começando nos anos 1950, 6, estas culturas conduziram a muito avanço na compreensão do programa murinemyogenic e, por extensão, miogenese em outros vertebrados. Além disso, uma única célula técnicas myofiber explantes têm aumentado a compreensão das interações entre células satélites e fibras musculares em torno 7-9. Culturas celulares são particularmente atraentes para as investigações de miogênese, devido ao c....
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Protocolo
Declaração de Ética: Todos experimentação envolvendo animais vertebrados descritos aqui foi previamente aprovado pelo Comitê da Universidade de Alabama em Birmingham Institutional Animal Care e Use e é consistente com as diretrizes estabelecidas pela Secretaria de Laboratório Animal Welfare, National Institutes of Health de os EUA Departamento de Saúde e Serviços Humanos.
1. Preparação para a Cultura
- Preparar o meio de base da seguinte forma: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L), em DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L).
- Determinar o pH e ajustar a 7,40 com HCl ou NaOH. <....
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Resultados
Vinte e quatro horas após a sementeira, as células precursoras miogénicos (PPM) deve ser visível ligado ao substrato de laminina (ver as figuras 1a e 1d). Após a sementeira, as células (PPM) adoptar uma forma fusiforme, indicativo desse tipo de células (Figura 1) e são MyoD1 + (Figura 2). Na espécie Danio, PPM parecem ser mais compacto, com processos bipolares menores do que os PPM de espécie Oncorhynchus e Salmo. No entanto, .......
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Discussão
O programa miogénica, em qualquer espécies examinadas, pode ser mais facilmente estudado por meio de um sistema in vitro. Com efeito, após o isolamento, as células precursoras miogénicos (PPM) em peixes ou células myosatellite (MSCs) em mamíferos facilmente entrar neste processo altamente regulado que envolve a proliferação, a retirada do ciclo celular, e a diferenciação terminal de mioblastos e a fusão dos mioblastos em miotubos nascentes. A falta generalizada de linhagens transgênicas repórter gene de espécie.......
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Divulgações
Não há nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de estender muitos agradecimentos aos Drs.. Josep Planas e Juan Castillo por sua experiência profissional no desenvolvimento e aplicação do presente protocolo cultura para pequenos peixes e anfíbios. Agradecimentos também são devidos aos inúmeros indivíduos que incansavelmente assistida com a dissecção e dissociação do tecido muscular de muitos peixes (tanto em espécies e número), incluindo Matthew carregamento, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily e Sinibaldo Romero. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Alabama em Birmingham Departamento de Biologia fundos de arr....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tabela 1. Informações detalhadas sobre | |||
| reagentes Reagent | Company (Preferencial v. Alternativo) | Número de catálogo (Preferido v. Alternativo) | Quantidade por cultura |
| γ-irradiado poli-L-lisina | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM (glicose alta) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| Laminina | BD Biosciences ( Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1,51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9,53 g |
| Antibiótico/Antimicótico | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL |
| de Sulfato | de GentamicinaLonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL |
| de doador Equino Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| de soro fetal bovino | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| de colagenase (tipo IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0,44 g |
| de tripsina (do pâncreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| Tabela 2. Consumíveis, Ferramentas e Equipamentos | |||
| Ferramentas de Consumo | Equipamento | ||
| Placas de Cultura de Células | Fórceps (Grosso) | Pipetador | |
| Estéril 50 mL Tubos Cônicos | Fórceps (Fino) | Medidor | |
| de pH Fita de Laboratório | Cabos de Bisturi | Incubadora de Resfriamento (Echotherm) | |
| 0.2 μ m Sistemas de Esterilização a Vácuo | Lâminas de bisturi (#10, #11) | Capuz | |
| Autoclave repelente de água Papel | Tesoura cirúrgica | Coletor de vácuo Pipetas | |
| sorológicas | de vidro Placas | Petri Medidor | |
| 12-16 G Cânulas com Luer Locks | |||
| Tabela 3. Volumes otimizados para revestimento de placas de cultura de células | |||
| Tamanho da placa | cm^2 por poço | Poli-L-lisina | *Laminina** |
| 6 poço | 9,5 | 1,6 mL | 1 |
| 24 poço | 1,9 | 0,32 | 0,2 |
| 48 poço | 0,95 | 0,16 | 0,1 |
| 96 poço | 0,32 | 0,06 | 0,03 |
| *0,1 mg/mL concentração | ** 0,020 mg/mL concentração | ||
| Tabela 4. Meios para isolamento, dissociação e isolamento de | |||
| reagentes | de cultura Wash | Dissociação | |
| Base Média | 419,25 mL | 395,40 mL | 297,00 mL |
| Sulfato de gentamicina** | 0,75 mL | 0,60 mL-Soro | |
| Equino do Doador | 75,00 mL | - | - |
| Soro Fetal Bovino*** | - | - | - |
| * PSF: penicilina/estreptomicina/coquetel de fungizona (100x); ** Concentração de 50 mg/mL; Caracterizado | |||
| Tabela 5. Diluições recomendadas e volumes de revestimento | |||
| Tamanho da placa | cm^2 por poço | de revestimento | diluição |
| 6 poços | 9,5 | 1,5-2,0x10^6 células/mL | 1 mL |
| 24 poços | 1,9 | 1,5-2,0x10^6 células/mL | 250 μ L |
| 48 poço | 0,95 | 1,5-2,0x10^6 células/mL | 150 μ L |
| 96 poço | 0,32 | 1,5-2,0x10^6 células/mL | 50-100 μ L |
| Tabela 6. Número médio de células por g de tecido | |||
| Espécie | Média # células/g de tecido | ||
| Danio rerio | 6.400.000 | ||
| Danio dangila | 1.783.000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1.797.000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66.800 | ||
| Tabela 7. Temperaturas de incubação recomendadas | |||
| Temperatura | da espécie | ||
| Danio/ Devario spp. | 26 - 28 &graus; C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10 * - 18 graus; C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18° C | ||
| * Temperaturas mais baixas suportam taxas de proliferação mais baixas. |
Referências
- Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
- Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J.
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Reimpressões e permissões
