La coloration histochimique de l'<em> Arabidopsis thaliana</em> Cellule secondaire Elements mur

Summary

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Abstract

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Introduction

La paroi de cellule végétale est titulaire d'une pléthore d'informations à l'intérieur de ses divers composants: la lignine, la cellulose, les hémicelluloses (xylane, glucuronoxylane, xyloglucane, arabinoxylane, glucane de liaison mixte, ou glucomannane), et de la pectine. Techniques histologiques fournissent des repères visuels importants dans l'étude des différences dans les parois secondaires au niveau organisationnel et cellulaires. Diverses techniques histologiques ont été développés et peuvent être trouvés dans la littérature, mais ces techniques peuvent être difficiles et fastidieux pour les débutants car protocoles très détaillés avec des instructions visuelles simples sont rarement, voire jamais disponible. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour les techniques de coloration histologique pour obtenir des images de haute qualité.

Sectionner le tissu de la tige est la première étape dans la visualisation des parois cellulaires et des formes cellulaires. Bien que les sections coupées à la main sont peu coûteux et prennent moins de temps pour se préparer, l'utilisation d'un vibratome offre cohérence etdonne des images de haute qualité. L'utilisation d'un vibratome permet de produire des données de meilleure qualité en générant même des sections avec la même épaisseur, ce qui permet de produire des images nettes et réduit de manière significative le risque de produire des différences entre les échantillons inexactes qui serait tout simplement causés par une mauvaise préparation de l'échantillon. Utilisation de résines pour fixer les échantillons frais peut être un défi pour les débutants et peut-être encore temps, même pour des experts quand une analyse qui doit être fait rapidement. En outre, il devient impossible de mesurer une quelconque activité biologique de l'échantillon lorsqu'il a été noyé dans une résine. Une technique simple qui utilise un moule d'agarose et fait maison est utile pour l'enrobage tissus de la tige, et elle peut également être utilisée dans d'autres applications nécessitant une dissection des tissus mous. Par rapport aux échantillons enrobage dans de la résine, ce procédé présente l'avantage de conserver les tissus vivants et de réduire la manipulation de l'échantillon. Sectionnement des tissus par un vibratome est très précis et génère homogenUO sections, qui, en fonction de l'objectif de l'étude, peuvent ensuite être utilisés avec plusieurs techniques de coloration différents.

Les méthodes les plus simples pour visualiser la lignine et d'autres composés aromatiques emploient les rayons ultraviolets (UV). Excitation des molécules aromatiques à base de lumière UV est une technique ancienne, mais il est encore l'un des plus rapides des approches pour la visualisation de la lignine. Cependant, la visualisation UV n'est effectivement pas idéal pour la détection de la lignine parce que la lumière UV va exciter d'autres composés aromatiques. La lignine est composé principalement de trois blocs de construction, les monolignols (alcools hydroxycinnamyl: alcool coniférylique, alcool sinapylique, et de l'alcool p-coumaryl) ^1-3. Phloroglucinol tache peut fournir des indices à la mesure de cinnamaldéhydes présents dans le xylème, de fibres et de tissus de la trachée ^4. Phloroglucinol est un bon indicateur de cinnamaldéhydes générales et peut différencier entre cinnamaldéhydes et d'autres composés aromatiques. Les monomères d'alcool sinapylique peuvent être détectéset différenciées par l'utilisation de Mäule taches. le bleu de toluidine O est un colorant polychromatique et a la capacité de colorer les différents éléments de la paroi cellulaire dans des couleurs différentes donc ^5,6. La principale utilisation de bleu de toluidine O est de détecter la pectine et de la lignine ^5,6. L'avantage d'utiliser le bleu de toluidine O, c'est que de nombreux éléments de la paroi cellulaire peuvent être visualisés en une seule étape. Les deux calcofluor blanc et rouge Congo sont faciles à travailler et peuvent être utilisés pour visualiser la cellulose. Calcofluor taches blanches cellulose, callose, et d'autres β-glucanes non-substitués ou substitués faiblement ^6-9, tandis que le congo taches rouges directement à β-(1 → 4)-glucanes et notamment de cellulose ^10,11. Le but de cette étude est de fournir des lignes directrices simples pour l'utilisation des techniques de coloration ci-dessus pour obtenir des images de haute qualité à partir de A. thaliana tiges.

Protocol

1. Souches Embedding Préparer une solution d'agarose à 7% dans l'eau (7 g d'agarose à une électrophorèse de qualité dans 100 ml d'eau distillée). Dissoudre la gélose par autoclavage pendant 20 min ou par micro-ondes pendant 20 min à la plus faible intensité (par exemple, une intensité de 1250 watts à micro-ondes de 10%). Préparer un moule maison pour intégrer les tiges à l'aide des flacons en plastique. En utilisant une lame de rasoir, coupez le f…

Representative Results

Tige inclusion et la coupe: L'utilisation du moule en matière plastique à incorporer le fait maison tiges dans 7% d'agarose révélée être rapide et facile (figure 1). Les deux parties (A et B; figure 1) du système de flacon intégré le rendent simple pour libérer facilement la tige intégré dans agarose comme l'agarose ne colle pas aux parties des flacons qui sont inertes, maintenir le système propre. Les flacons peuvent être réutilisés plusieurs fois pen…

Discussion

Sections de la tige A. thaliana sont largement utilisés pour étudier l'organisation des cellules dans la paroi de la cellule secondaire et pour examiner les différences entre qualitativement type sauvage et des plantes transgéniques. Les techniques couramment utilisées pour sectionner les spécimens sont coupe de main directe; ou lorsque les spécimens sont intégrés dans agarose ou fixateur, la coupe peut être fait avec un vibratome ou microtome. A la différence de la découpe de la main, les deux …

Materials

Agarose	EMD	MERC2125	CAS Number: 9012-36-6
Phloroglucinol	Sigma	P 3502	1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]
Hydrochloric Acid	EMD	HX0603-75	CAS Number: 7647-01-0
Ammonium hydroxide	EMD	AX1303-6	CAS Number: 1336-21-6
Toulidine Blue O	Sigma	T3260	Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9]
Potassium permanganate	Sigma	223468	CAS Number 7722-64-7
Ethanol 190 proof	KOPTEC	V1401	CAS Number: 64-17-5
Congo Red	Sigma	C6277	Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ]
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain	Sigma	F3543	4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7]
Vibratome	Leica	Leica Vibrating blade microtome VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
Razor	American Safety razor company	Item # 60-0139-0000	Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml)	VWR	16466-044
Microcentrifuge Tubes (0.6ml)	Axygen Scientific	MCT-060-C
Mitt	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE  Hot Hand Protector Mitt
Tissue adhesive	Ted Pella Inc	10033	Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer  storage
Microwave	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive
Camera with CCD chip with no mechanical shutter	Hamamatsu	C4742-95
High speed color camera	QImaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Camera software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.0.0
Imagining anaylsis	Adobe	Photoshop CS4
Micro Cover Glasses, Square, No.1	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm.
Frosted Micro Slides, 1mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm- 1mm
TX2 Filter cube	Leica	11513851/11513885	Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.
Parafilm M	Alcan packaging	BRNDPM998