Histochemische Färbung von<em> Arabidopsis thaliana</em> Sekundärzellwand-Elemente
Summary
Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.
Abstract
Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.
Introduction
Die Pflanzenzellwand hält eine Fülle von Informationen innerhalb seiner verschiedenen Komponenten: Lignin, Cellulose, Hemicellulose (Xylan, Glucuronoxylan, Xyloglukan, Arabinoxylans, gemischte Verknüpfung Glucan oder Glucomannan) und Pektin. Die histologische Techniken liefern wichtige visuelle Hinweise in Studium Unterschiede innerhalb der sekundären Zellwände auf organisatorischer und zellulärer Ebene. Verschiedene histologische Techniken wurden entwickelt und kann in der Literatur gefunden werden, aber diese Techniken kann schwierig und zeitaufwendig für Anfänger sein, weil sehr ausführliche Protokolle mit einfachen visuellen Anweisungen sind selten, wenn überhaupt vorhanden. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien zur histologischen Färbung Techniken bieten, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten.
Unterteilen des Schaftgewebe ist der erste Schritt bei der Visualisierung von Zellwänden und Zellformen. Obwohl von Hand geschnitten Abschnitte sind kostengünstig und weniger Zeit für die Vorbereitung, die Verwendung eines Vibratom bietet Kontinuität undliefert qualitativ hochwertige Bilder. Mit einem Vibratom ermöglicht die Herstellung besserer Datenqualität durch die Erzeugung auch Abschnitte mit der gleichen Stärke, die hilft, scharfe Bilder und reduziert das Risiko der Herstellung ungenau Unterschiede zwischen den Proben, die einfach von einer schlechten Probenvorbereitung verursacht werden würde. Mit Harze an die frische Proben zu beheben, kann eine Herausforderung für Anfänger und kann immer noch zeitaufwändig sein, selbst für Experten, wenn eine Analyse muss schnell durchgeführt werden. Darüber hinaus wird es unmöglich, irgendeine biologische Aktivität der Probe zu messen, wenn es in ein Harz eingebettet sind. Eine einfache Technik, die Agarose und eine hausgemachte Form beschäftigt ist hilfreich für die Einbettung von Stammzellen Gewebe, und es kann auch in anderen Anwendungen Dissektion der Weichteile erfordern, genutzt werden. Im Vergleich zu Proben in Harz eingebettet, hat dieses Verfahren den Vorteil, dass das Gewebe gesund und reduzierendem Probenmanipulation. Schneiden Gewebe über einen Vibratoms ist sehr präzise und homogen erzeugtschiedenen Abschnitten, die je nach dem Ziel der Studie kann dann mit verschiedenen Färbetechniken verwendet werden.
Die einfachsten Methoden, um Lignin und andere Aromaten visualisieren beschäftigen ultraviolettem (UV) Licht. Anregung der aromatischen Moleküle auf durch UV-Licht ist eine alte Technik, aber es ist immer noch eine der schnellsten Ansätze zur Visualisierung von Lignin. Doch tatsächlich ist die UV-Visualisierung nicht ideal für die Erkennung Lignin, weil UV-Licht werden andere Aromaten zu erregen. 1-3: Lignin besteht hauptsächlich aus drei Bausteinen, die Monolignole (Coniferylalkohol, Sinapylalkohol und p-Cumarylalkohol hydroxycinnamyl Alkohole) gemacht. Phloroglucin Flecken können Hinweise auf den Umfang der in das Xylem, Fasern und Luftröhrengewebe 4 vorhanden Zimtaldehyde bereitzustellen. Phloroglucinol ist ein guter Indikator für die allgemeine Zimtaldehyde und kann zwischen Zimtaldehyde und anderen Aromaten unterscheiden. Die Sinapylalkohol Monomere nachgewiesen werden kannund differenziert durch die Verwendung Maule Fleck. Toluidinblau O eine polychromatische Farbstoff und hat die Fähigkeit, verschiedene Elemente der Zellwand in verschiedenen Farben färben daher 5,6. Der primäre Einsatz von Toluidinblau O ist es, Pektin und Lignin 5,6 zu erkennen. Der Vorteil der Verwendung von Toluidinblau O ist, dass viele Elemente der Zellwand kann in einem einzigen Schritt dargestellt werden. Sowohl Calcofluor weiß und Kongorot sind leicht zu verarbeiten und kann verwendet werden, um Zellulose zu visualisieren. Calcofluor weißen Flecken Cellulose, Callose und andere nicht-substituierten oder schwach substituierten β-Glucane 6-9, während Kongorot Flecken direkt an β-(1 → 4)-Glucane und insbesondere zu Cellulose 10,11. Das Ziel dieser Studie ist es, einfache Richtlinien für die Verwendung der oben genannten Färbetechniken, um qualitativ hochwertige Bilder von A zu erhalten bieten thaliana stammt.
Protocol
Representative Results
Discussion
A. thaliana Stammabschnitte werden häufig verwendet, um die Organisation der Zellen in der sekundären Zellwand zu untersuchen und qualitativ untersuchen die Unterschiede zwischen Wildtyp und transgenen Pflanzen. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Schneiden der Proben sind direkte schneidend; oder, wenn Proben in Agarose-oder Fixiermittel eingebettet ist, kann mit einem Schnitt Vibratom oder Mikrotom durchgeführt werden. Im Gegensatz zu schneidend, die letzten beiden ermöglichen die Verringerung de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Bearbeitung von Sabin Russell Unterstützung. Diese Arbeit war Teil des DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) durch das US Department of Energy, Office of Science, Office of Biological-und Umweltforschung, unterstützt durch Vertrag DE-AC02-05CH11231 zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und das US Department of Energy.
Materials
| Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
| Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
| Hydrochloric Acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
| Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
| Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
| Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
| Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
| Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ] |
| Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
| Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
| Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
| Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) | VWR | 16466-044 | |
| Microcentrifuge Tubes (0.6ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
| Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
| Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer storage |
| Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
| Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
| High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
| Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No.1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. |
| Frosted Micro Slides, 1mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm- 1mm |
| TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
| Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 |
Referências
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