Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.
Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%), and lignin (20–30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas Mäule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.
A parede celular da planta tem uma infinidade de informações dentro de seus vários componentes: lignina, celulose, hemicelulose (xilana, glucuronoxylan, xiloglucano, arabinoxilano, ligação mista glucana, ou glucomanana) e pectina. Técnicas histológicas fornecer dicas visuais importantes no estudo das diferenças dentro das paredes celulares secundárias a nível da organização e celulares. Várias técnicas histológicas foram desenvolvidos e podem ser encontrados na literatura, mas estas técnicas pode ser um desafio para principiantes e demorada porque os protocolos muito detalhado com instruções visuais simples são raramente, se alguma vez disponível. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para técnicas de coloração histológicas para obter imagens de alta qualidade.
Seccionamento do tecido do tronco é o primeiro passo para a visualização de células e paredes celulares de formas. Embora seções cortados à mão são baratos e levam menos tempo para se preparar, o uso de um vibratome oferece consistência eproduz imagens de alta qualidade. Usando um vibratome permite produzir melhor qualidade de dados, gerando até secções com a mesma espessura, o que ajuda a produzir imagens nítidas e reduz significativamente o risco de produzir diferenças entre amostras imprecisos que seria simplesmente causada por uma preparação de amostra mau. Usando resinas para fixar espécimes frescos pode ser um desafio para iniciantes e ainda pode ser demorado, mesmo para especialistas, quando uma análise precisa ser feito rapidamente. Além disso, torna-se impossível de medir qualquer actividade biológica com a amostra quando tiver sido incorporado numa resina. Uma técnica simples que emprega um molde de agarose e caseiro é útil para a incorporação de tecidos do caule, e que também pode ser utilizado em outras aplicações que requerem uma dissecção de tecidos moles. Em comparação com a incorporação de espécimes em resina, este método tem a vantagem de manter os tecidos vivos e reduzindo a manipulação da amostra. Seccionamento dos tecidos por meio de um vibratome é altamente preciso e gera homogeneaous secções, que, dependendo do objectivo do estudo, poderá, então, ser usados com várias técnicas de coloração diferentes.
Os métodos mais simples de visualizar lignina e outros compostos aromáticos empregar ultravioleta (UV). Excitação de moléculas aromáticas à base de luz UV é uma técnica antiga, mas ainda é uma das abordagens mais rápido para visualização de lignina. No entanto, a visualização UV na verdade não é ideal para a detecção de lignina porque a luz UV vão animar outros compostos aromáticos. A lignina é composta basicamente de três blocos de construção, as monolignóis (álcoois hidroxicinamil: álcool coniferil, álcool sinapyl e álcool p-cumaril) 1-3. Floroglucinol mancha pode proporcionar pistas para a extensão da cinnamaldehydes presentes no xilema, fibras e tecidos da traqueia 4. Floroglucinol é um bom indicador de cinnamaldehydes gerais e pode diferenciar entre cinnamaldehydes e outros aromáticos. Os monómeros de álcool sinapyl pode ser detectadae diferenciando-se pelo uso de Maule mancha. Azul de toluidina O é um corante policromático e, portanto, tem a capacidade de manchar os diferentes elementos da parede celular em diferentes cores 5,6. O principal uso do azul de toluidina O é detectar pectina e lignina 5,6. A vantagem do uso de azul de toluidina O é que muitos elementos da parede da célula pode ser visualizado num único passo. Ambos calcoflúor branco e vermelho congo são fáceis de trabalhar e pode ser usado para visualizar celulose. Calcofluor manchas brancas celulose, calose, e outros β-glucanas não-substituídos ou substituídos fracamente 6-9, ao passo que congo manchas vermelhas directamente para β-(1 → 4)-glucanos e em particular a celulose 10,11. O objetivo deste estudo é fornecer orientações simples para o uso das técnicas de coloração acima mencionados para obter imagens de alta qualidade a partir de A. thaliana hastes.
Secções tronco de A. thaliana são amplamente usados para o estudo da organização das células da parede celular secundária e para examinar qualitativamente as diferenças entre o tipo selvagem e plantas transgénicas. As técnicas comumente utilizadas para a secção dos espécimes são corte manual direta; ou quando as amostras são incorporados em agarose ou fixador, o seccionamento pode ser feito com um vibratome ou micrótomo. Em contraste com o lado de corte, os dois últimos permitem reduzir o…
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos a Sabin Russell para a assistência edição. Este trabalho fez parte do Instituto Joint BioEnergy DOE (http://www.jbei.org), apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Instituto de Pesquisa Ambiental e Biológica, por meio do contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratório Nacional e do Departamento de Energia dos EUA.
Agarose | EMD | MERC2125 | CAS Number: 9012-36-6 |
Phloroglucinol | Sigma | P 3502 | 1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6] |
Hydrochloric Acid | EMD | HX0603-75 | CAS Number: 7647-01-0 |
Ammonium hydroxide | EMD | AX1303-6 | CAS Number: 1336-21-6 |
Toulidine Blue O | Sigma | T3260 | Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9] |
Potassium permanganate | Sigma | 223468 | CAS Number 7722-64-7 |
Ethanol 190 proof | KOPTEC | V1401 | CAS Number: 64-17-5 |
Congo Red | Sigma | C6277 | Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ] |
Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain | Sigma | F3543 | 4,4'-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2'-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7] |
Vibratome | Leica | Leica Vibrating blade microtome VT1000S | http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/ |
Razor | American Safety razor company | Item # 60-0139-0000 | Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super) |
Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml) | VWR | 16466-044 | |
Microcentrifuge Tubes (0.6ml) | Axygen Scientific | MCT-060-C | |
Mitt | Bel-Art | 380000000 | SCIENCEWARE Hot Hand Protector Mitt |
Tissue adhesive | Ted Pella Inc | 10033 | Store at 4°C or 20°C for 3 months or longer storage |
Microwave | Panasonic | NN-SD762S | PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive |
Camera with CCD chip with no mechanical shutter | Hamamatsu | C4742-95 | |
High speed color camera | QImaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
Camera software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.0.0 | |
Imagining anaylsis | Adobe | Photoshop CS4 | |
Micro Cover Glasses, Square, No.1 | VWR | 48366-067 | 22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm. |
Frosted Micro Slides, 1mm | VWR | 48312-003 | 75 x 25 mm- 1mm |
TX2 Filter cube | Leica | 11513851/11513885 | Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40. |
Parafilm M | Alcan packaging | BRNDPM998 |