这里提出的技术措施的采用单一波长曝光自由游动微观品种的路径。C。线虫是用于演示的阴影成像作为一种廉价的替代昂贵的显微镜。这种技术可以适于容纳各种取向,环境和物种测量方向,速度,加速度和力。
这项研究表明,一种廉价和简单的技术,它允许的物理性能如位置,速度,加速度和参与线虫悬浮在水中的柱响应于单一波长的光的运动器官行为力的测量。我们将演示如何评估使用单波长阴影成像(SWSI)使用两个不同的例子一个微小的有机体的运动。
第一个例子是C的平均下降系统和统计学上可行的研究线虫中的水柱。在这项研究中,我们使用了活着和死去的野生型C。线虫。当我们比较线虫主动运动的速度和方向与引力场中死虫的被动血统,这项研究表明在血统倍没有差别。平均下降为1.5毫米/秒±0.1毫米/秒为使用633nm的相干的活的和死虫光。
第二个例子是个人选择C的个案研究线虫在垂直水柱下降改变方向。加速度和力在本实施例进行分析。此案例研究展示了可以使用SWSI同时使用单一波长的环境中,是不是与传统的显微镜评估访问行为进行评估的其他物理特性的范围。使用这种分析,我们估计个别线虫能够与超过28 NN力助推的。
我们的研究结果表明,生活线虫施加28 NN转动或移动对引力场的时候。研究结果进一步表明,线虫被动下降的水柱,但可以积极抵御重力的作用主要是通过转动的方向。
秀丽隐杆线虫是一种自由生活的有益土壤线虫是一个功能强大的模式生物用于研究基因调控,发展和更多的新机制对于理解感官生物学和行为。尽管有只有302个神经元,C。线虫有能力的复杂运动器官的形态,繁殖行为,导航,趋化性和许多其他行为。C。线虫具有机械感受器,化学感受器,甚至侦测光线的蓝色波长(Ward 等 ,2008)1。虽然很多人知道感觉功能的神经回路和C.一般运动器官的形态线虫 ,更少有人知道的回应多个并发的刺激或比可以在显微镜下进行建模更复杂的环境条件。一些研究发现更复杂的运动器官的图案,高塑性2,3,4。我们的方式方法,使NEM研究atodes在溶液中实时在这里我们可以很容易地同时提供多种环境条件。这个问题很难用传统的显微镜为基础的成像技术来解决。我们已经开发了一种成像技术,使我们能够把线虫水柱内检查运动器官的行为,以及确定线虫的能力来改变运动的响应不同的环境条件。
单波长阴影成像(SWSI)列于本文首次以解决传统显微镜的缺点。传统的显微镜限于观察物种在水平焦平面几微米的深度5,6。对于单波长的研究中,最传统的显微镜用彩色滤光片非常广泛,通常为50-100纳米过滤白光。利用激光对SWSI变窄波长选择为小于1纳米,同时保持标志ificant光强7。同样,单一波长已被用于测量C的游泳频率线虫实时8。
对于我们方法的第一个示范,我们监测的水平位置,x和垂直位置,Y,自由游动C的线虫的水柱,在约一厘米的距离。特别是,我们感兴趣的是垂直运动,因为重力也垂直地作用。线性拟合到垂直位置的斜率给出的垂直速度的线虫,V Y,因为它下降的水柱:
(1)
的均方根误差(RMSE)9的平方表示拟合的质量和表示的下降速度是否是大致恒定的。垂直速度,然后平均为选管会h种和死虫。利用这些结果,拖动,它的蠕虫经验可估计。
对于我们方法的第二个演示中,我们选择了C。线虫未以恒定的速率下降多数观察到的蠕虫的不同。所选择的蠕虫或者掉头向上游泳或持续下降前徘徊了一会儿。在物理上,这种情况下,研究表明,游泳微生物的推力可以计算出来。牛顿定律支配的一个改变方向的身体加速,这意味着净力, ,是作用于该机构10:
(2)
哪里是线动量,t是时间。蠕虫的加速度成正比作用于蜗杆的力量,因为该蠕虫的质量保持不变。其结果是,垂直的净力为:
(3)
其中m是蠕虫的质量和y表示垂直加速度。在垂直方向上的净力表示接着蜗杆推力在同一方向上。总推力可以通过采取水平分量在内进行计算。
该SWSI技术提供了解微观生物一样自由生活线虫的运动器官功能的另一种方式。有了这个技术,我们积极运动(游泳)和被动漂移之间有区别,由于对死线虫重力操作。此外,当自由游动的线虫在运动过程中水改变方向,我们能够测量阻力和角的力量,这是经营上的线虫和线虫作用。
线虫所遇到的土壤内的不同的环境条件。有内土壤水分的口袋,以及固体颗粒和不同的形状和纹理的生物材料。此外,线虫内,他们以14回应重力环境中存在。此外,在土壤的表面附近线虫暴露于不同波长的光,变化的温度和湿度,以及生物变量,如细菌,真菌掠夺和其他土壤生物。线虫必须应对所有这些不同的变量,游泳和爬行在不同的媒体,转弯和改变导航策略。所有这些复杂的计算仅由302个神经元,一个子集,其中所涉及的运动,和95的体壁肌肉细胞进行。通过SWSI技术描述的那种测量提供重要的洞察线虫如何做到这一点的导航的复杂性。
在第一部分,我们已经测量野生型C的整体下降速度线虫在633纳米的光。使用这些测量,我们可以估算阻力蠕虫的遭遇。
为加速线虫的案例研究中,势力不断介入,因为有速度的拖曳力变化的变化。有一些报表,我们能够做出关于作用在蠕虫的力量。作为蜗轮减速并试图向swIM向上的阻力的垂直分量降低,直到达到零线虫的轨迹的最低点。在这一点上,该蠕虫必须有一个向上的力来游泳了。
此方法可以以多种方式进行修改。该导航在一种透明的液体的任何微小物质可以使用SWSI进行跟踪。研究可以与可访问的数码相机的任何波长进行。数码相机通常会拿起波长范围从紫外到近红外。此外,水平的研究可通过垂直向上引导激光进行。该物种可以被放置在水平表面上的透明,如显微镜载玻片。调整扩束器或放大镜扩束后,可以锐化模糊的图像。用户应确实锁紧所有组件表中,以确保一致且易于光束准直。
该方法是通过使用激光wavelengt不限HS和分辨率。在本质上,这方法比现有的显微镜,它是在方向和波长的灵活性的优点,也是缺点,因为安装是简单的。激光的古朴光学和斑点限制了分辨率。一些这些缺点当然是可以在将来通过包括空间滤波器,并直接将图像投影到CCD相机得到改善。
可以很容易地了解到在该协议中最关键的步骤,在第一次进行的实验。而不产生湍流放置线虫中的反应杯是至关重要的。另外,振动可能会干扰设置和改变的蠕虫的行为。一定要限制功率,这是用来遮蔽图像。 2毫瓦的激光束为1毫米的直径应为最大,以避免加热效果。设置应在使用液体比蒸馏水等散射效应进行测试。
目前,大多数米使用白光或彩色过滤器,它们仍然非常广泛的波长范围内的水平面上icroscopes操作。显微镜,真正使用单一波长,并具有灵活性,在观察的情况下, 即水平放置,通常仅限于一个优势或其他。此外,这些类型的显微镜通常是非常昂贵的,仍局限于焦平面我们的方法不同。我们的设置可以很容易地用极低的预算建造。这种方法是随时可以使用的学校,环保公司以及其他实体,与小资金操作。在未来,这种方法可以用在一个非常复杂的设置,研究运动和微观物质的机械感觉实时特效。这种方法使单波长的研究在大范围角度和容易获得的观看深处。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢在瓦瑟学院本科生暑期研究协会(URSI),露西·梅纳德·三文鱼研究基金,美国航空航天局颁发号NX09AU90A,美国国家科学基金会研究中心卓越科学与技术(NSF-CREST)号裁决的支持0630388和美国国家科学基金会奖号码1058385。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |