Техника, представленная здесь измеряет путь свободно плавающих микроскопических видов использования экспозицию одной длине волны. С. Элеганс используются для демонстрации теневой визуализации в качестве недорогой альтернативы дорогостоящим микроскопов. Эта техника может быть адаптирована для размещения различных ориентаций, условий и видов для измерения направления, скорости, ускорения и силы.
Это исследование показывает, недорогой и простой метод, который позволяет измерять физические свойства, такие как положение, скорость, ускорение и сил, участвующих в опорно-двигательного поведения нематод, взвешенных в колонке воды в ответ на одной длине волны света. Мы показываем, как оценить передвижения микроскопического организма с использованием одной длины волны Shadow томография (SWSI) с использованием двух различных примеров.
Первый пример представляет собой систематический и статистически жизнеспособным изучение среднего спуска С. Элеганс в столбце воды. Для этого исследования мы использовали живые и мертвые дикого типа C. Элеганс. Когда мы сравнили скорость и направление нематод активного движения с пассивным спуска мертвых червей в пределах гравитационного поля, это исследование не выявило различий в родовому раз. Средняя спуск был 1,5 мм / сек ± 0,1 мм / сек для обоих живых и мертвых червей, использующих 633 нм когерентноесвет.
Второй пример на примере выбора индивидуального C. Элеганс изменения направления при спуске в вертикальном столбе воды. Ускорение и сила анализируются в этом примере. Это исследование демонстрирует сферу других физических свойств, которые можно оценить с помощью SWSI при оценке поведения с помощью монохромная в среде, которая не доступна с традиционными микроскопов. Используя этот анализ мы оценили индивидуальный нематода способна толкать с силой, превышающей 28 нн.
Наши данные показывают, что нематоды оказывают 28 Н.Н. при повороте или перемещение против гравитационного поля. Результаты позволяют предположить, что нематоды пассивно сходить в колонке воды, но может активно противостоять силе тяжести, прежде всего, направление поворота.
Caenorhabditis Элеганс является свободно живущих выгодно нематода почвы, что является мощным модельным организмом для изучения механизмов регуляции генов, развития и совсем недавно для понимания сенсорную биологию и поведение. Несмотря на то, только 302 нейронов, С. Элеганс способны сложными узорами двигательных, репродуктивного поведения, навигации, хемотаксиса и многие другие виды поведения. С. Элеганс обладают механорецепторы, хеморецепторы и даже обнаружить синие длины волн света (Уорд и др.., 2008) 1. В то время как много известно о нейронной схемы функции сенсомоторной и общих двигательных паттернов в С. Элеганс, меньше известно о ответах на нескольких, одновременно стимулы или более сложных условиях окружающей среды, чем можно моделировать под микроскопом. Несколько исследований показали, более сложные локомоторных паттернов, которые очень пластик 2,3,4. Наш методологический подход позволит исследования NEMatodes в растворе в режиме реального времени, где мы можем легко обеспечить несколько условий окружающей среды одновременно. На этот вопрос трудно решить с помощью обычных методов визуализации микроскопа на основе. Мы разработали метод визуализации, который позволяет нам разместить нематод в толще воды изучить локомоторных поведения, а также определить возможности нематод изменить передвижение в ответ на различных условиях окружающей среды.
Одноместный Длина волны Тень томография (SWSI) представлена в данной работе впервые преодоления недостатков традиционных микроскопов. Традиционные микроскопы ограничены наблюдать виды в горизонтальной фокальной плоскости несколько микрон в глубину 5,6. Что касается отдельных исследований длин волн, большинство традиционных микроскопов использовать цветные фильтры для фильтрации белый свет очень широко, как правило, 50-100 нм. С помощью лазера для SWSI сужает выбор длины волны менее 1 нм при сохранении знакаificant интенсивность света 7. Аналогично, одиночный длины волн были использованы для измерения частоты плавательных С. Элеганс в режиме реального времени 8.
Для первой демонстрации нашего метода, мы отслеживаем горизонтальное положение, х, и вертикальное положение, у, о свободно плавание C. Элеганс в толще воды, на расстоянии около сантиметра. В частности, мы заинтересованы в вертикальном движении с гравитация действует также вертикально. Наклон линейной подгонки в вертикальное положение дает вертикальную скорость, Ф Х, нематоды как это происходит в толще воды:
(1)
Среднеквадратичное ошибки (СКО) 9 указывает на качество подгонки и указывает скорость опускания, как правило, постоянна. Вертикальные скорости затем усредняются для ВАСч виды и мертвые черви. Используя эти результаты, сопротивление, которое опыт черви могут быть оценены.
Для второй демонстрации нашего метода мы выбрали C. Элеганс, что не сходили с постоянной скоростью в отличие от большинства червей наблюдаемых. Выбранные черви либо развернулся и поплыл вверх или завис на некоторое время, прежде чем продолжить спуск. Физически это пример показывает, что направленность плавательный микроорганизма могут быть рассчитаны. Законы Ньютона диктуют, что орган, который меняет направления ускоряется, что предполагает чистую силу, , Является действующая на этого органа 10:
(2)
где являетсялинейный импульс и т время. Ускорение червя прямо пропорциональна силе, действующей на червя так как масса червя остается постоянным. В результате вертикальная сила чистый:
(3)
где т-масса червя и у представляет вертикальное ускорение. Результирующая сила в вертикальном направлении представляет Затем червь тягу в том же направлении. Общее тяги может быть рассчитана путем принятия горизонтальный компонент во внимание.
Техника SWSI обеспечивает дополнительный способ понять опорно-двигательного возможности микроскопических организмов, таких как свободноживущих нематод. С помощью этой техники мы различали активного передвижения (плавание) и пассивного дрейфа из-за тяжести работает на мертвых нематод. Кроме того, при свободное плавание нематоды изменить направление во время передвижения в воде, мы можем измерить силы торможения и угловые силы, которые действуют на нематод и прилагаемые нематод.
Нематоды столкнуться с различными экологических условий в почве. Есть водные карманы внутри почвы, а также твердые частицы и биологические материалы различных форм и текстур. Кроме того, нематоды существовать в гравитационной окружающей среды, что они реагируют на 14. Кроме того, нематоды вблизи поверхности почвы подвергаются воздействию различных длин волн света, изменения в температуре и влажности, а также биологическиепеременные, такие как бактерии, хищных грибов и других почвенных организмов. Нематоды должна реагировать на все эти различные переменные, плавательный и ползающих в различных средах, поворота и изменения навигационные стратегии. Все эти сложные вычисления осуществляются только 302 нейронов, подмножество, которые участвуют в передвижении, и 95 тела стена мышечных клеток. Измерения рода описываемой SWSI техники обеспечивают важное понимание, как нематоды выполнить эту навигационную сложности.
Для первой части, мы измерили общую скорость нисходящего от дикого типа С. Элеганс в 633 нм света. С помощью этих измерений, можно оценить силу сопротивления червь встреч.
Для тематического исследования ускоряющего нематоды, силы вовлечены изменения непрерывно с изменениями сила сопротивления со скоростью. Есть некоторые заявления, которые мы в состоянии сделать о силах, действующих на червя. Как червь замедляется и пытается SWим вверх вертикальная составляющая силы сопротивления уменьшается, пока не достигнет нуля в нижней точке траектории нематоды в. В этот момент, червь должен иметь направленную вверх силу плавать вверх.
Этот способ может быть модифицирован различными способами. Любые микроскопические виды, которые переходит в прозрачной жидкости можно отслеживать с помощью SWSI. Исследования можно проводить с любыми длинами волн, которые доступны для цифровых камер. Цифровые камеры, как правило, подобрать диапазоне длин волн от УФ до ближнего ИК. Кроме того, горизонтальные исследования можно проводить, направляя лазерный луч вертикально вверх. Виды затем может быть помещен на горизонтальную поверхность прозрачной, как стекло микроскопа. Регулировка расширитель луча или лупу после расширителя пучка может обострить размытые изображения. Пользователь должен быть уверен, чтобы закрепить все компоненты к столу, чтобы обеспечить последовательное и легкий выравнивание луча.
Метод ограничено доступной лазерной wavelengtУГ и разрешение. В сущности преимущества этого метода по существующим микроскопов, которые являются гибкость в направлениях и длин волн, также слабые, так как установка проста. Неискушенного оптика и пятен лазера ограничивать разрешение. Некоторые из этих недостатков, конечно, могут быть улучшены в будущем путем включения пространственного фильтра и проецирования изображения непосредственно на ПЗС-камеры.
Наиболее критические шаги в протоколе могут быть легко узнал как эксперимент проводится в первый раз. Размещение нематоды в кювете, не создавая турбулентность имеет решающее значение. Кроме того, вибрации могут нарушить установку и изменить поведение червей. Обязательно ограничить власть, которая используется в тень изображение. 2 мВт для лазерного луча, который является 1 мм в диаметре должно быть максимальным, чтобы избежать нагрева эффекты. Установка должна быть проверена для рассеяния эффектов при использовании, кроме дистиллированной воды жидкостей.
В настоящее время большинство мicroscopes работать на горизонтальной плоскости с помощью белого света или цветных фильтров, которые все еще очень широк в диапазоне длин волн. Микроскопы, которые действительно используется монохромная и имеют гибкость в просмотре сценария, то есть горизонтальное положение, как правило, ограничивается одним преимуществом или другой стороны. Кроме того, эти типы микроскопов, как правило, очень дорого и по-прежнему ограничивается фокальных плоскостях отличие нашего метода. Наша установка может быть легко построены с очень низким бюджетом. Этот метод готов к использованию в школах, экологических компаний, а также других лиц, которые работают с небольшим финансированием. В будущем этот метод может быть использован в очень сложной настройки для изучения реальных последствий для передвижения и mechanosensation микроскопических видов времени. Этот метод дает одиночные исследования длин волн в широком диапазоне углов обзора и глубины легко доступны.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны за поддержку Колледж Вассар Бакалавриат исследований Летний институт (URSI), лосось исследовательского фонда Люси Мейнард, награда НАСА номер NX09AU90A, Национальный Фонд Центр науки по научной квалификации в области науки и техники (NSF-CREST) решение № 0630388 и NSF решение № 1058385.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
High Speed Exilim Camera | Casio | ||
Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
5x – 10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |