Summary
Questo protocollo descrive un metodo per l'estrazione di piccoli RNA da siero umano. Abbiamo usato questo metodo per isolare microRNA da siero cancro per uso in matrici di DNA e anche singleplex PCR quantitativa. Il protocollo utilizza fenolo e guanidina tiocianato reagenti con modifiche a produrre RNA di alta qualità.
Abstract
L'analisi di RNA e la sua espressione è una caratteristica comune in molti laboratori. Di rilievo è la nascita di piccoli RNA come microRNA, che si trovano nelle cellule di mammifero. Questi piccoli RNA sono geni regolatori potenti che controllano le vie vitali come la crescita, lo sviluppo e la morte e molto interesse è stato rivolto al loro espressione nei fluidi corporei. Ciò è dovuto alla loro disregolazione in malattie umane come il cancro e il loro potenziale applicazione come biomarker sierici. Tuttavia, l'analisi di espressione miRNA nel siero può essere problematico. Nella maggior parte dei casi la quantità di siero è limitante e siero contiene basse quantità di RNA totale, di cui piccoli RNA costituiscono solo 0,4-0,5% 1. Così l'isolamento di una quantità sufficiente di RNA qualità dal siero è una sfida importante per i ricercatori di oggi. In questo documento tecnico, si dimostra un metodo che utilizza solo 400 ml di siero umano per ottenere RNA sufficiente sia per matrici di DNA o analisi qPCR. L'unadvantages di questo metodo sono la sua semplicità e la capacità di produrre RNA di alta qualità. Non richiede colonne specializzati per la purificazione dei piccoli RNA e utilizza reagenti generali e hardware presenti nei laboratori comuni. Il nostro metodo si usa un blocco Gel Fase per eliminare la contaminazione fenolo mentre allo stesso tempo cedevole RNA di alta qualità. Abbiamo anche introdurre un ulteriore passo per rimuovere ulteriormente tutti gli agenti inquinanti durante la fase di isolamento. Questo protocollo è molto efficace per isolare rese di RNA totale fino a 100 ng / ml di siero ma può anche essere adattato per altri tessuti biologici.
Introduction
Negli ultimi anni, c'è stata una spinta crescente a scoprire nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce delle malattie umane. Molta attenzione è stata focalizzata sull'uso di piccoli RNA come microRNA 2 (miRNA o miR) come potenziali marcatori. Questi piccoli RNA sono presenti nei fluidi corporei come siero e studi hanno dimostrato che sono resistenti alla degradazione e sono stabili in un intervallo di variazione delle condizioni ambientali 3. Poiché questi miRNA caratteristiche, siero o circolanti sono il biomarcatore ideale 4, 5. Attualmente ci sono due approcci principali per l'isolamento di piccoli RNA da fluidi biologici. Il primo approccio utilizza la tecnologia basata su colonne di impegnare ed eluire i piccoli RNA 6, mentre il secondo approccio utilizza il protocollo di lunga data con fenolo e guanidina tiocianato reagenti 7. Abbiamo sviluppato un efficace, semplice protocollo, senza colonne per isolare piccoli RNA da siero umano. L'RNA isolato è immediatamentediatamente utilizzabili in applicazioni a valle, compresi gli array di oligonucleotidi di DNA e RNA sequenziamento.
Questo protocollo è stato sviluppato perché eravamo di fronte a diversi problemi quando si utilizzano metodi basati fenolo-per isolare l'RNA dal siero. L'approccio tradizionale Chomczynski è spesso utilizzato nella maggior parte dei laboratori con una gamma di reagenti disponibili dalla maggior parte dei fornitori commerciali. Tuttavia, considerando la loro diffusione, non sono stati sviluppati orientamenti rigorosi per produrre costantemente RNA di alta qualità da fluidi corporei, in particolare sangue o siero.
Problemi comuni associati con isolare RNA da siero comprendono basse rese di RNA e la contaminazione con reagenti utilizzati durante l'isolamento, in particolare fenolo. Il nostro approccio elimina questi contaminanti fenolo per fornire RNA di alta qualità per l'analisi a valle come la PCR quantitativa (qPCR) e RNA sequenziamento. Abbiamo inoltre testato questo RNA array miRNA.
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Protocol
Nota: campioni di siero umano da pazienti sani o pazienti con cancro sono stati ottenuti con il consenso informato ai sensi approvati i protocolli etici umani del Royal Prince Alfred Hospital di Sydney (numero di protocollo X10-0016 e HREC/10/RPAH/24) e l'University of Technology, Sydney. I campioni di siero sono stati raccolti da pazienti prima dell'intervento chirurgico da vari ospedali di Sydney e posti in stoccaggio a -80 ° C.
1. Small RNA Isolation da siero
L'RNA totale è stato preparato da siero umano utilizzando una versione modificata del protocollo LS Tri-Reagent RT.
- Scongelare campione di siero congelato su ghiaccio e poi il trasferimento di 400 ml di siero appena scongelato in una provetta etichettata.
- Diluire il siero con 100 ml di RNasi libero H 2 O e aggiungere proteinasi K alla concentrazione di 1 mg / ml.
- Incubare a 37 ° C per 20 minuti per consentire la digestione delle proteine da proteinasi K.
- To garantire la completa solubilizzazione, aggiungere 1,5 volte il suo volume di Tri-reagente RT LS e 100 ml di 4-bromoanisole.
- Brevemente invertire l'omogeneizzato, eseguire pipettaggio ripetitivo per 5 secondi e trasferire in una provetta etichettata 2 ml Heavy Phase Lock.
- Centrifugare l'omogeneizzato a 12.000 xg per 20 min a 4 ° C.
- Decantare attentamente almeno 1 ml di soluzione acquosa risultante in una fiala LoBind DNA. L'interfase organico e dovrebbe essere intrappolato sotto il gel bianco del tubo Phase Lock.
- Aggiungere 5,0 ml di glicogeno (5 mg / ml) e 500 ml di isopropanolo al 100% alla soluzione acquosa, miscelare capovolgendolo, e incubare O / N a -20 ° C.
- Seguendo O / N incubazione, centrifugare il campione per 20 minuti a 12.000 xg in una centrifuga 4 ° C.
- Eliminare il surnatante limpido ed effettuare un giro "flash" per 2 min a 16.000 × g in un 4 ° C centrifuga.
- Rimuovere con attenzione il chiaro solution circonda il pellet con una pipetta.
- Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare a 10.000 xg per 10 min. Decantare la soluzione di lavaggio e ripetere la fase di lavaggio.
2. RNA Resuspension in Solution
- Risospendere il pellet in 10 ml di RNasi libero H 2 O, garantendo il pellet è completamente sciolto. Per assicurare che l'RNA viene completamente solubilizzata il campione può essere riscaldata a 55 ° C per 5 min. Durante questo tempo, mescolare il campione con pipettaggio ripetuto. Per un rendimento RNA totale più alto, in comune due preparazioni di RNA dallo stesso paziente.
- Quantificare l'RNA risospeso con un UV-Vis spettrofotometro e valutare la qualità RNA utilizzando un bioanalizzatore 2100. Conservare i campioni di RNA aggregati a -80 ° C per uso nelle applicazioni a valle.
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Representative Results
Figura 1 rappresenta un tipico spettro UV / Vis di RNA isolato dal siero. Da questo profilo abbiamo notato contaminazione proteina a 280 nm con fenolo e contaminanti organici sia a 270 nm e 230 nm, rispettivamente. Residue guanidina tiocianato stato inoltre osservato a 260 nm. Per ridurre i contaminanti, una serie di passaggi di ottimizzazione hanno fatto la procedura RT-LS Tri-reagente standard. Abbiamo aggiunto 5 mg / ml di glicogeno di aumentare sia il rendimento totale RNA e ridurre la contaminazione (linea nera, Figura 1A).
Ulteriore abbiamo osservato che dopo la rimozione di isopropanolo c'era circa 100-300 microlitri di tampone di lavaggio che circonda il pellet di RNA. Un giro centrifuga supplementare è stato aggiunto al protocollo e la soluzione di lavaggio residuo è stato accuratamente rimosso. Questo ha prodotto uno spostamento profilo da 270 nm a 280 nm (traccia rossa, Figura 1B). Abbiamo dedotto che questo spin "flash" aveva ridotto la contaminazione fenoloa 270 nm e concludere che il picco di 280 nm probabilmente rappresentato contaminazione proteina.
Per aumentare ulteriormente la resa di RNA e proteine ridurre carry attraverso abbiamo aggiunto un passo Phase Lock Gel. Questo passaggio consentito per il completo trasferimento della fase acquosa senza contaminanti organici (Figura 1B). Come siero contiene una grande abbondanza di proteine, abbiamo valutato se diluendo il volume siero originale sarebbe alcuna differenza (Figura 1C). In un volume totale di 500 microlitri estratto, abbiamo mescolato 400 e 250 microlitri di siero con dH 2 O. La resa grande volume quasi raddoppiato la quantità di RNA totale quando confrontarle con 250 microlitri di siero. C'è stata anche una riduzione dei contaminanti quando diminuendo il volume iniziale (Nota: Poiché l'unica variabile in questa fase di ottimizzazione è il volume di siero, il picco di 230 nm è direttamente associato con volumi di siero e non un artefatto dall'isolamento Tri-Reagent) . Il piccolo contenuto di RNA di queste preparazioni è stata poi valutata usando il Bioanalyzer in combinazione con il Kit Small RNA. Dal tracciato Bioanalizzatore, c'è un picco distinto a circa 20 nt che rappresenta la popolazione microRNA (Figura 2A). Usando questo protocollo, questa componente microRNA ha rappresentato il 93% della popolazione totale piccolo RNA. Questo è un elevato grado di purezza e l'RNA totale può essere utilizzato per variare saggi molecolari come array e reazioni qPCR. Una sintesi del flusso di lavoro è presentato in Figura 2B.
Abbiamo poi misurato l'espressione del microRNA in quattro differenti campioni biologici utilizzando una matrice oligonucleotide o qPCR. Figura 3A rappresenta una mappa di calore microRNA di questi quattro campioni. Come nel nostro studio precedente, clustering gerarchico è stato utilizzato per analizzare i dati di espressione e campioni di gruppo sulla base del loro profilo di espressione microRNA 8. QuantitativoPCR (qPCR) è stato utilizzato anche per valutare i livelli di microRNA in queste preparazioni. Utilizzando gli stessi quattro campioni, abbiamo effettuato singleplex reazioni TaqMan qPCR per rilevare miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p e let-7 bis. Come mostrato nei grafici di amplificazione (figure 3b e 3c) tutti i miRNA Sono stati rilevati.
Figura 1. Profilo spettrofotometrico di RNA da siero umano. A. Un profilo tipico UV di RNA isolato dal siero umano (linea blu). Vari passaggi di ottimizzazione sono stati testati per ridurre contamina e aumentare il rendimento totale RNA. B. confronta l'uso di un blocco Gel Fase ad un isolamento normale. C. Profilo di due misure con diversi volumi iniziali di siero. Aumentare il volume h Annuncio segnato impatto sui rendimenti di RNA. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. A. rappresentativa Bioanalyzer traccia che mostra un unico picco a circa 21 nucleotidi (asse x). Questo picco rappresenta la frazione miRNA nella popolazione dei piccoli RNA dal siero. B. Sintesi del flusso di lavoro per isolare RNA totale dal siero. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. I microRNA isolati con questo metodo sono stati utilizzati per la matrice profiling e analisi qPCR. A. Tre tumori testa e collo e una sieri normali sono stati isolati per l'RNA totale (compresi i microRNA) e sottoposti a matrice profiling usando l'8 chip di X 60K miRNA. Questo è stato ripetuto in replicati tecnici. Dopo che i dati grezzi controllo qualità (QC) elaborazione, espressione di questi microRNA è stata analizzata usando Hierarchical Clustering (HCL) e presentata come una mappa di calore. Il rosso indica up regolamentazione e blu indica down-regolazione dei microRNA. B. rappresentativa qPCR curve di amplificazione per la rilevazione di miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 e let-7a in quattro sieri umani. C. Tutti cinque miRNA sono stati rilevati e valori Ct prime sono state poi tracciate per il siero normale. Questo modello di rilevamento era simile per le altre tre campioni (dati non mostrati)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La popolazione dei microRNA costituisce circa il 0,4-0,5% del RNA totale ritrovate nel siero. Inoltre vi è anche un alto contenuto proteico trovato nel siero umano. Per migliorare RNA e ridurre proteine e fenolo contamina abbiamo modificato il tradizionale approccio Chomczynski 9 con l'aggiunta di diversi passaggi.
L'RNA totale è stato isolato dal siero utilizzando lo standard Tri-Reagent RT-LS (Centro di Ricerca Molecolare) tuttavia quando eseguite nel nostro laboratorio, questo metodo ha dato RNA in basse quantità con vari contaminanti.
La Figura 1 mostra un profilo RNA spettrofotometrica UV con tracce di contaminazione proteina a 280 nm, contaminazione fenolo a 270 nm, e altri contaminanti organici a 230 nm. Il reagente, guanidina tiocianato, è stato anche riscontrato a 260 nm.
Per risolvere i problemi di rendimento RNA basse siero e ridurre la contaminazione, una serie di optimizatprocedura di ioni sono stati aggiunti alla procedura RT-LS Tri-reagente standard. In primo luogo, abbiamo trovato che diluendo il siero 1 a 5 contaminazione proteina ridotta. Questo passaggio è stato raccomandato da altri studi 10 e ha dimostrato di ridurre la contaminazione proteina. Inoltre, abbiamo utilizzato 1 concentrazione mg / ml di proteinasi K. Abbiamo testato un intervallo di concentrazioni da 100, 500 e 1000 mg. Non c'era differenza tra le concentrazioni così abbiamo utilizzato concentrazioni più elevate e periodi di incubazione più brevi.
La seconda modifica è stato quello di introdurre l'uso dei 2,0 ml provette Phase Lock. Il pesante Phase Lock Gel intrappola la maggior parte dei contaminanti come fenolo e proteine nella fase organica. Esso fornisce una barriera densità per il massimo trasferimento di fase acquosa senza il rischio di contaminazione. L'applicazione del blocco Gel Fase come materiale acquosa / organica fase barriera può diminuire il tempo di lavorazione e migliorare ulteriormente recupe DNAery di ben il 30%, mentre allo stesso tempo eliminare l'utente da esposizione a sostanze organiche volatili nocive 11. La terza modifica ha comportato un notevole miglioramento nella qualità dell'RNA. L'introduzione di un "flash" centrifuga centrifugazione a 12,000 xg era importante nel rimuovere qualsiasi contaminazione residua di pellet di RNA prima dei lavaggi etanolo.
Quando si confrontano nostro approccio ad altre metodologie pubblicato 6, 12, 13, abbiamo introdotto l'uso di un blocco Gel Fase di massimizzare il recupero di piccoli RNA non codificanti dalla fase acquosa. Uno dei limiti del nostro protocollo ed altri è che isolamenti replicate possono essere necessarie per ottenere abbastanza RNA per l'analisi di espressione. Dalle nostre esperienze, preferiamo i metodi basati Trizol oltre i kit basati su colonne e numerosi studi hanno confrontato i meriti di entrambi i sistemi 6, 14-16. Di particolare interesseè stato un recente studio che ha concluso che i miRNA con basso contenuto di GC, come miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a e miR-34a, selettivamente persi durante la preparazione del campione utilizzando il metodo Trizol 17. Questo problema è stato risolto con l'aggiunta di magnesio durante l'isolamento campione.
In sintesi, il protocollo utilizza i metodi tradizionali per isolare piccoli RNA da siero. Questi miRNA siero possono essere derivate da micro-particelle, exosomes o cellule morenti. Questo protocollo dovrebbe isolare tutti questi miRNA per la produzione di RNA di alta qualità che può essere utilizzato per varie applicazioni molecolari a valle. Questo metodo di estrazione è abbastanza semplice, si basa su hardware comuni che si trovano nella maggior parte dei laboratori, ed è abbastanza semplice per la maggior parte dei novizi interessate a misurare l'espressione dei miRNA nel siero umano.
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Samantha Khoury e Pamela Ajuyah sono supportati dalla Australian Postgraduate Award. Vorremmo inoltre ringraziare il Translational Cancer Research Network, Lowy Centro di Ricerca sul Cancro, Università del New South Wales e l'Unità di ricerca sul cancro del Nord traslazionale per il loro sostegno supplementare di Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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