Summary
इस प्रोटोकॉल मानव सीरम से छोटे RNAs निकालने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. हम डीएनए सरणियों में इस्तेमाल के लिए कैंसर सीरम से microRNAs अलग और भी singleplex मात्रात्मक पीसीआर के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता शाही सेना उपज के लिए संशोधनों के साथ फिनोल और guanidinium thiocyanate अभिकर्मकों का इस्तेमाल करता.
Abstract
शाही सेना और उसकी अभिव्यक्ति का विश्लेषण कई प्रयोगशालाओं में एक आम सुविधा है. महत्व के स्तनधारी कोशिकाओं में पाए जाते हैं जो microRNAs, जैसे छोटे RNAs के उद्भव है. इन छोटे RNAs इस तरह के विकास, विकास और मृत्यु और ज्यादा ब्याज के रूप में महत्वपूर्ण रास्ते को नियंत्रित शक्तिशाली जीन नियामकों शारीरिक तरल पदार्थ में उनकी अभिव्यक्ति के निर्देश पर किया गया है. इस तरह के कैंसर और सीरम बायोमार्कर के रूप में उनके संभावित आवेदन के रूप में मानव रोगों में उनके अनियंत्रण की वजह से है. हालांकि, सीरम में miRNA अभिव्यक्ति की विश्लेषण समस्याग्रस्त हो सकता है. ज्यादातर मामलों में सीरम की मात्रा सीमित है और सीरम छोटे RNAs केवल 0.4-0.5% 1 का गठन जिनमें से कुल शाही सेना के कम मात्रा में होता है. इस प्रकार सीरम से गुणवत्ता शाही सेना की पर्याप्त मात्रा के अलगाव के शोधकर्ताओं के लिए एक बड़ी चुनौती बन गई है. इस तकनीकी पत्र में, हम डीएनए सरणियों या qPCR विश्लेषण के लिए या तो पर्याप्त शाही सेना प्राप्त करने के लिए मानव सीरम की केवल 400 μl का उपयोग करता है जो एक विधि का प्रदर्शन. एकइस विधि के dvantages अपनी सादगी और उच्च गुणवत्ता शाही सेना उपज करने की क्षमता है. यह छोटे RNAs की शुद्धि के लिए कोई विशेष स्तंभों की आवश्यकता है और आम प्रयोगशालाओं में पाया जनरल अभिकर्मकों और हार्डवेयर का इस्तेमाल करता. हमारे विधि एक ही समय में उच्च गुणवत्ता शाही सेना से बेदखल करते हुए फिनोल प्रदूषण को खत्म करने के लिए एक चरण ताला जेल का इस्तेमाल करता. हम भी आगे अलगाव चरण के दौरान सभी को दूर करने के लिए एक अतिरिक्त कदम परिचय. इस प्रोटोकॉल सीरम से 100 एनजी / μl की कुल शाही सेना की पैदावार को अलग करने में बहुत प्रभावी है, लेकिन यह भी अन्य जैविक ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता.
Introduction
हाल के वर्षों में, मानव रोगों का जल्दी पता लगाने के लिए उपन्यास बायोमार्कर की खोज के लिए एक से बढ़ धक्का दिया गया है. बहुत ध्यान संभावित मार्कर के रूप में इस तरह के microRNAs 2 (miRNAs या miRs) के रूप में छोटे RNAs का उपयोग पर ध्यान केंद्रित किया गया है. इन छोटे RNAs ऐसे सीरम और अध्ययन के रूप में शरीर के तरल पदार्थ में पाए जाते हैं वे गिरावट को लचीला कर रहे हैं और अलग पर्यावरणीय परिस्थितियों 3 की एक सीमा से अधिक स्थिर रहे हैं पता चला है. इन सुविधाओं, सीरम या परिसंचारी miRNAs आदर्श biomarker 4, 5 को देखते हुए. वर्तमान में जैविक तरल पदार्थ से छोटे आरएनए के अलगाव के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण हैं. दूसरा दृष्टिकोण फिनोल और guanidinium thiocyanate अभिकर्मकों 7 के साथ लंबे समय से चली आ रही प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, जबकि पहले दृष्टिकोण, छोटे RNAs 6 बाँध और elute करने के लिए स्तंभ आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है. हम मानव सीरम से छोटे RNAs अलग करने के लिए एक सरल, प्रभावी, स्तंभ मुक्त प्रोटोकॉल विकसित किया है. पृथक शाही सेना तुरंत हैडीएनए oligonucleotide सरणियों और शाही सेना अनुक्रमण सहित बहाव के अनुप्रयोगों में ately प्रयोग करने योग्य.
सीरम से शाही सेना को अलग करने के लिए फिनोल आधारित विधियों का उपयोग करते समय हम कई मुद्दों के साथ सामना कर रहे थे, क्योंकि यह प्रोटोकॉल विकसित किया गया था. पारंपरिक Chomczynski दृष्टिकोण अक्सर सबसे वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध अभिकर्मकों की एक सीमा के साथ सबसे प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है. हालांकि उनके व्यापक उपयोग पर विचार, कड़े दिशा निर्देशों लगातार विशेष रक्त या सीरम में, शारीरिक तरल पदार्थों से उच्च गुणवत्ता शाही सेना का उत्पादन करने के लिए विकसित नहीं किया गया है.
सीरम से शाही सेना को अलग करने के साथ जुड़े आम समस्याओं कम शाही सेना पैदावार और अलगाव, विशेष रूप से फिनोल के दौरान इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के साथ संदूषण शामिल हैं. हमारा दृष्टिकोण इस तरह के मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) और शाही सेना अनुक्रमण के रूप में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए प्रदान करने के लिए इन फिनोल contaminants समाप्त. हम आगे miRNA सरणियों पर इस शाही सेना का परीक्षण किया है.
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Protocol
नोट: स्वस्थ रोगियों या कैंसर के साथ रोगियों से मानव सीरम के नमूने, रॉयल प्रिंस अल्फ्रेड अस्पताल सिडनी (प्रोटोकॉल संख्या X10-0016 और HREC/10/RPAH/24) और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से अनुमोदित मानव नैतिक प्रोटोकॉल के तहत सूचित सहमति के साथ प्राप्त किया गया सिडनी. सीरम नमूनों विभिन्न सिडनी अस्पतालों से सर्जरी से पहले रोगियों से एकत्र और -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण में रखा गया
सीरम से 1. लघु शाही सेना अलगाव
कुल शाही सेना त्रिकोणीय अभिकर्मक आरटी लोकसभा प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण का उपयोग मानव सीरम से तैयार किया गया था.
- बर्फ पर जमे हुए सीरम नमूना पहले गला लें और फिर एक लेबल microcentrifuge ट्यूब में हौसले से thawed सीरम के 400 μl हस्तांतरण.
- RNase मुक्त एच 2 ओ के 100 μl के साथ सीरम पतला और 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में proteinase कश्मीर जोड़ें.
- Proteinase लालकृष्ण द्वारा प्रोटीन पाचन अनुमति देने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते
- टीओ, पूरा solubilization सुनिश्चित त्रिकोणीय अभिकर्मक आरटी लोकसभा के 1.5 गुना इसकी मात्रा और 4 bromoanisole के 100 μl जोड़ें.
- संक्षेप में, homogenate पलटना 5 सेकंड के लिए दोहराव pipetting प्रदर्शन और एक लेबल 2 मिलीलीटर भारी चरण ताला ट्यूब में हस्तांतरण.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 × छ पर homogenate स्पिन
- ध्यान से एक ताजा डीएनए Lobind ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप जलीय घोल का कम से कम 1 मिलीलीटर छानना. जैविक और अंतरावस्था चरण ताला ट्यूब की सफेद जेल के नीचे फंस जाना चाहिए.
- , जलीय घोल को ग्लाइकोजन के 5.0 μl (5 मिलीग्राम / एमएल) और 100% isopropanol के 500 μl जोड़ें उलटा द्वारा मिश्रण है, और -20 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते
- निम्नलिखित हे / एन ऊष्मायन, एक 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र में 12,000 × छ पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नमूना.
- स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एक 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र में 16,000 × जी पर 2 मिनट के लिए एक "फ़्लैश" स्पिन प्रदर्शन करते हैं.
- ध्यान से स्पष्ट प हटानेएक पिपेट का उपयोग कर गोली आसपास के ution.
- 10 मिनट के लिए 10,000 × छ पर 70% इथेनॉल और अपकेंद्रित्र के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें. धोने के समाधान छानना और धोने कदम दोहराएँ.
समाधान में 2. शाही सेना मेजबान
- गोली पूरी तरह भंग है, यह सुनिश्चित करना RNase मुक्त एच 2 ओ के 10 μl में गोली Resuspend. शाही सेना पूरी तरह से solubilized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नमूना 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता. इस दौरान दोहराया pipetting साथ नमूना मिश्रण. एक उच्च कुल शाही सेना उपज के लिए, एक ही रोगी से दो शाही सेना की तैयारी पूल.
- एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग resuspended आरएनए quantitate और एक 2100 Bioanalyzer उपयोग कर शाही सेना गुणवत्ता का आकलन करें. बहाव के अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा शाही सेना के नमूने संग्रहित करें.
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Representative Results
चित्रा 1 सीरम से अलग शाही सेना के एक ठेठ यूवी / विज़ स्पेक्ट्रम का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रोफाइल से हम क्रमशः, दोनों 270 एनएम और 230 एनएम पर फिनोल और जैविक contaminants के साथ 280 एनएम प्रोटीन संदूषण का उल्लेख किया. अवशेष guanidinium thiocyanate भी 260 एनएम पर उल्लेख किया गया था. Contaminants को कम करने के लिए, अनुकूलन कदम की एक श्रृंखला मानक त्रिकोणीय अभिकर्मक RT-रास प्रक्रिया के लिए किए गए थे. हम कुल शाही सेना उपज दोनों में वृद्धि और प्रदूषण (काला लाइन, चित्रा 1 ए) को कम करने के लिए ग्लाइकोजन की 5 मिलीग्राम / एमएल गयी.
इसके अलावा हम isopropanol को हटाने के बाद शाही सेना गोली आसपास धोने बफर के मोटे तौर पर 100-300 μl था कि वहाँ मनाया. एक अतिरिक्त अपकेंद्रित्र स्पिन प्रोटोकॉल को जोड़ा गया है और छाछ धोने समाधान ध्यान से हटा दिया गया था. यह 280 एनएम (लाल निशान, चित्रा 1 बी) के लिए 270 एनएम से एक प्रोफाइल पाली में हुई. हम इस "फ़्लैश" स्पिन फिनोल संदूषण कम था कि deduced270 एनएम और 280 एनएम चोटी की संभावना सबसे अधिक प्रोटीन संदूषण प्रतिनिधित्व संपन्न हुआ.
आगे शाही सेना उपज बढ़ाने के लिए और हम के माध्यम से प्रोटीन ले कम करने के लिए एक चरण ताला जेल कदम गयी. यह कदम जैविक contaminants (चित्रा 1 बी) के बिना जलीय चरण के पूरा हस्तांतरण के लिए अनुमति दी. सीरम प्रोटीन की एक बड़ी बहुतायत होता है के रूप में मूल सीरम की मात्रा कम करने के मामले में कोई अंतर (चित्रा 1C) करना होगा, अगर हम मूल्यांकन किया है. 500 μl की कुल निकालने मात्रा में, हम DH 2 ओ के साथ सीरम के 400 और 250 μl मिलाया सीरम के 250 μl का उपयोग करने के लिए तुलना जब बड़ी मात्रा में उपज लगभग कुल शाही सेना की मात्रा दोगुनी हो. (: इस अनुकूलन कदम में ही चर सीरम की मात्रा के रूप में था, 230 एनएम चोटी सीधे सीरम संस्करणों के साथ जुड़े रहे हैं और सप्ताह में तीन अभिकर्मक अलगाव से नहीं एक artifact है नोट) प्रारंभिक मात्रा कम जब contaminants में कमी भी आई थी . इन तैयारियों के छोटे आरएनए सामग्री तो छोटे आरएनए किट के साथ संयोजन में Bioanalyzer उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. Bioanalyzer ट्रेस से, microRNA आबादी (2A चित्रा) का प्रतिनिधित्व करता है जो लगभग 20 एनटीएस में एक अलग चोटी है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, इस microRNA घटक कुल छोटे आरएनए आबादी का 93% का प्रतिनिधित्व किया. यह पवित्रता का एक उच्च स्तरीय है और कुल शाही सेना अब ऐसे सरणियों और qPCR प्रतिक्रियाओं के रूप में आणविक assays बदलती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कार्यप्रवाह का एक सारांश चित्रा 2B में प्रस्तुत किया है.
हम तो एक oligonucleotide सरणी या qPCR का उपयोग चार अलग अलग जैविक नमूने में microRNA अभिव्यक्ति मापा. चित्रा 3A इन चार नमूनों की एक microRNA गर्मी नक्शे का प्रतिनिधित्व करता है. हमारे पिछले अध्ययन के रूप में, पदानुक्रम क्लस्टरिंग उनके microRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल 8 के आधार पर डेटा की अभिव्यक्ति और समूह के नमूनों का विश्लेषण किया गया था. मात्रात्मकपीसीआर (qPCR) भी इन तैयारियों में microRNA स्तर का आकलन किया गया था. वही चार नमूनों का प्रयोग, हम मीर 21 5p, मीर 486-5p, मीर 15b-5p, मीर 16 5p और जाने-7A पता लगाने के लिए singleplex TaqMan qPCR प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया. प्रवर्धन भूखंडों (आंकड़े 3B और 3 सी) में दिखाया गया है सभी miRNAs सफलतापूर्वक पता चला रहे थे.
चित्रा 1. मानव सीरम से शाही सेना के spectrophotometric प्रोफाइल. मानव सीरम (ब्लू लाइन) से अलग शाही सेना के ए एक ठेठ यूवी प्रोफाइल. विभिन्न अनुकूलन कदम contaminates को कम करने और कुल शाही सेना उपज बढ़ाने के लिए परीक्षण किया गया. बी एक सामान्य अलगाव के लिए एक चरण ताला जेल का उपयोग सीरम के विभिन्न प्रारंभिक संस्करणों के साथ दो माप की. सी. प्रोफ़ाइल तुलना करता है. मात्रा घंटे बढ़ाने से शाही सेना पैदावार पर विज्ञापन के रूप में चिह्नित प्रभाव. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. ए प्रतिनिधि Bioanalyzer लगभग 21 nucleotides (एक्स अक्ष) पर एक कील दिखा ट्रेस. इस कील सीरम से छोटे आरएनए आबादी सीरम से कुल शाही सेना को अलग करने के लिए कार्यप्रवाह की. बी सारांश में miRNA अंश का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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चित्रा 3. इस विधि का उपयोग कर अलग microRNAs सरणी रूपरेखा और qPCR विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया. ए थ्री सिर और गर्दन के कैंसर और एक सामान्य सीरा (microRNAs सहित) कुल शाही सेना के लिए अलग और 8 एक्स 60K miRNA चिप का उपयोग सरणी रूपरेखा के अधीन थे. यह तकनीकी replicates में दोहराया गया था. कच्चे डेटा गुणवत्ता नियंत्रण (QC) प्रसंस्करण के बाद, इन microRNAs की अभिव्यक्ति पदानुक्रमित क्लस्टरिंग (एचसीएल) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया गया था और एक गर्मी नक्शे के रूप में प्रस्तुत किया. लाल विनियमन ऊपर इंगित करता है और नीले microRNAs के विनियमन नीचे इंगित करता है. मीर -21, मीर 486, मीर 15, मीर 16 और जाने-7A चार मानव सीरा में. सी. सभी का पता लगाने के लिए बी प्रतिनिधि qPCR प्रवर्धन घटता पांच miRNAs पता चला रहे थे और कच्चे सीटी मूल्यों फिर सामान्य सीरम के लिए साजिश रची थे. पता लगाने की यह पैटर्न अन्य तीन नमूने (नहीं दिखाया डेटा) के लिए समान था..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
microRNAs की आबादी सीरम में पाया कुल शाही सेना के लगभग 0.4-0.5% का गठन किया. इसके अलावा मानव सीरम में पाया एक उच्च प्रोटीन सामग्री भी है. शाही सेना में सुधार और प्रोटीन और फिनोल दोनों को कम करने के लिए हम कई कदम के साथ साथ पारंपरिक Chomczynski दृष्टिकोण 9 संशोधित किया है contaminates.
हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जब कुल शाही सेना मानक त्रिकोणीय अभिकर्मक RT-रास (आण्विक अनुसंधान केन्द्र) का उपयोग सीरम से अलग किया गया था हालांकि, इस पद्धति विभिन्न contaminants के साथ कम मात्रा में शाही सेना झुकेंगे.
चित्रा 1 280 एनएम, 270 एनएम पर फिनोल संदूषण, और 230 एनएम पर अन्य कार्बनिक contaminants में प्रोटीन संदूषण के सबूत के साथ एक यूवी spectrophotometric आरएनए प्रोफाइल से पता चलता है. अभिकर्मक, guanidinium thiocyanate, भी 260 एनएम पर खोजा गया था.
कम सीरम शाही सेना पैदावार की समस्याओं से निपटने और प्रदूषण, Optimizat की एक श्रृंखला को कम करने के लिएआयन कदम मानक त्रिकोणीय अभिकर्मक RT-रास प्रक्रिया में शामिल थे. सबसे पहले, हमने पाया कि 5 कम प्रोटीन संदूषण में सीरम 1 गिराए. यह कदम अन्य अध्ययनों से 10 से सिफारिश की गई है और प्रोटीन प्रदूषण को कम करने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, हम 1 मिलीग्राम / एमएल हम 100 से सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण किया था proteinase कश्मीर की एकाग्रता, 500, और 1000 ग्राम का इस्तेमाल किया. सांद्रता के बीच कोई अंतर नहीं है, इस प्रकार हम उच्च सांद्रता और कम ऊष्मायन अवधि का उपयोग किया नहीं था.
दूसरा संशोधन 2.0 मिलीलीटर चरण ताला ट्यूब का उपयोग शुरू करने की थी. भारी चरण ताला जेल में इस तरह के जैविक चरण में फिनोल और प्रोटीन के रूप में contaminants के बहुमत जाल. यह संक्रमण के जोखिम के बिना जलीय चरण का अधिकतम हस्तांतरण के लिए एक घनत्व बाधा प्रदान करता है. एक जलीय / जैविक चरण बाधा सामग्री के रूप में चरण ताला जेल के आवेदन प्रसंस्करण समय कम होती है और आगे डीएनए recov सुधार कर सकते हैंजितना 30% द्वारा ery, एक ही समय में हानिकारक अस्थिर ऑर्गेनिक्स 11 के लिए जोखिम से उपयोगकर्ता को नष्ट करते हुए. तीसरे संशोधन शाही सेना गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ. 12,000 × छ पर एक "फ़्लैश" centrifugation स्पिन की शुरूआत से पहले इथेनॉल washes के लिए शाही सेना गोली से किसी भी अवशिष्ट संदूषण को दूर करने में महत्वपूर्ण था.
अन्य प्रकाशित तरीके 6, 12, 13 के लिए हमारे दृष्टिकोण की तुलना, हम जलीय चरण से छोटे noncoding RNAs के वसूली को अधिकतम करने के लिए एक चरण ताला जेल का उपयोग शुरू कर दिया है. हमारे प्रोटोकॉल और दूसरों की सीमाओं में से एक को दोहराने isolations अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पर्याप्त शाही सेना प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है. अपने अनुभवों से, हम स्तंभ आधारित किट और कई अध्ययनों से अधिक Trizol आधारित विधियों दोनों प्रणालियों 6, 14-16 की खूबियों की तुलना में है पसंद करते हैं. की विशेष रूप से ब्याजऐसे मीर 141, मीर 29b, मीर -21, मीर 106b, मीर 15A, और मीर 34A के रूप में कम जीसी सामग्री के साथ miRNAs, चुनिंदा Trizol विधि का उपयोग नमूना तैयार करने के दौरान खो रहे हैं निष्कर्ष निकाला है कि जो हाल ही में एक अध्ययन किया गया था 17. इस समस्या नमूना अलगाव के दौरान मैग्नीशियम के अलावा द्वारा हल किया गया था.
संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल सीरम से छोटे RNAs अलग करने के लिए पारंपरिक तरीकों का उपयोग करता है. ये सीरम miRNAs सूक्ष्म कणों, exosomes या मर कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल बहाव के विभिन्न आणविक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो उच्च गुणवत्ता शाही सेना का उत्पादन करने के लिए इन सभी miRNAs अलग होगा. इस निष्कर्षण विधि काफी स्पष्ट है, सबसे प्रयोगशालाओं में पाया आम हार्डवेयर पर निर्भर करता है, और मानव सीरम में miRNAs अभिव्यक्ति को मापने में दिलचस्पी सबसे novices के लिए काफी आसान है.
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Disclosures
खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
सामन्था Khoury और पामेला Ajuyah ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार द्वारा समर्थित हैं. हम भी सामन्था Khoury के उनके अतिरिक्त सहायता के लिए translational कैंसर रिसर्च नेटवर्क, Lowy कैंसर रिसर्च सेंटर, न्यू साउथ वेल्स विश्वविद्यालय और उत्तरी translational कैंसर रिसर्च यूनिट को स्वीकार करना होगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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