Summary
Este protocolo describe un método para la extracción de ARN pequeños a partir de suero humano. Hemos utilizado este método para aislar los microARNs de suero de cáncer para su uso en arrays de ADN y PCR cuantitativa singleplex. El protocolo utiliza fenol y tiocianato de guanidina reactivos con modificaciones para producir ARN de alta calidad.
Abstract
El análisis de ARN y su expresión es una característica común en muchos laboratorios. De importancia es la aparición de pequeños RNAs como microARN, que se encuentran en células de mamífero. Estos pequeños RNAs son potentes reguladores de genes que controlan las vías vitales como el crecimiento, el desarrollo y la muerte y un gran interés se ha dirigido a su expresión en los fluidos corporales. Esto es debido a su desregulación en enfermedades humanas tales como el cáncer y su aplicación potencial como biomarcadores séricos. Sin embargo, el análisis de la expresión de los genes miARN en el suero puede ser problemático. En la mayoría de los casos, la cantidad de suero es limitante y el suero contiene bajas cantidades de ARN total, de los cuales los pequeños RNAs sólo constituyen 0,4-0,5% 1. Así, el aislamiento de cantidades suficientes de ARN de calidad a partir de suero es un gran desafío para los investigadores en la actualidad. En este documento técnico, se demuestra un método que utiliza solamente 400 l de suero humano para obtener suficiente ARN, ya sea para los arrays de ADN o análisis qPCR. El unV entajas de este método son su simplicidad y la capacidad para producir ARN de alta calidad. No requiere de columnas especializadas para la purificación de ARN pequeños y utiliza reactivos generales y hardware que se encuentran en los laboratorios comunes. Nuestro método utiliza un gel de bloqueo de fase para eliminar la contaminación de fenol mientras que al mismo tiempo produciendo ARN de alta calidad. También introducimos un paso adicional para quitar aún más todos los contaminantes durante la etapa de aislamiento. Este protocolo es muy eficaz en el aislamiento de los rendimientos de ARN total de hasta 100 ng / l de suero, pero también se puede adaptar para otros tejidos biológicos.
Introduction
En los últimos años, ha habido un creciente impulso para descubrir nuevos biomarcadores para la detección precoz de enfermedades humanas. Mucha atención se ha centrado en el uso de pequeños RNAs como microRNAs 2 (miRNAs o MIR) como marcadores potenciales. Estos pequeños RNAs se encuentran en los fluidos corporales tales como suero y los estudios han mostrado que son resistentes a la degradación y son estables en un intervalo de diferentes condiciones ambientales 3. Teniendo en cuenta estas características, suero o circulan miRNAs son el marcador ideal 4, 5. Actualmente hay dos enfoques principales para el aislamiento de ARN pequeño de los fluidos biológicos. El primer enfoque utiliza tecnología basada en columnas para atar y eluir los pequeños RNAs 6, mientras que el segundo enfoque utiliza el protocolo de larga data con fenol y tiocianato de guanidina reactivos 7. Hemos desarrollado un protocolo simple, eficaz, libre de columnas para aislar ARN pequeños a partir de suero humano. El ARN aislado es inmediatamentetamente utilizable en aplicaciones posteriores, incluyendo arrays de oligonucleótidos de ADN y la secuencia de ARN.
Este protocolo fue desarrollado porque nos enfrentamos a varios problemas cuando se utilizan métodos basados en fenol para aislar el ARN de suero. El enfoque tradicional Chomczynski se utiliza con frecuencia en la mayoría de laboratorios con una gama de reactivos disponibles de la mayoría de los proveedores comerciales. Sin embargo teniendo en cuenta su uso generalizado, las estrictas directrices no se han desarrollado para producir consistentemente ARN de alta calidad a partir de fluidos corporales, en sangre o suero particular.
Los problemas comunes asociados con el aislamiento de ARN a partir de suero incluyen los rendimientos de ARN bajos y la contaminación con los reactivos utilizados durante el aislamiento, en particular fenol. Nuestro enfoque elimina estos contaminantes fenol para proporcionar ARN de alta calidad para el análisis de aguas abajo tal como la PCR cuantitativa (qPCR) y la secuenciación de ARN. Hemos probado más este ARN en arrays miARN.
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Protocol
Nota: Las muestras de suero humano de pacientes sanos o pacientes con cáncer se obtuvieron con el consentimiento informado bajo protocolos éticos humanos aprobados desde el Royal Prince Alfred Hospital de Sydney (Número de protocolo X10-0016 y HREC/10/RPAH/24) y la Universidad de Tecnología, Sydney. Las muestras de suero se obtuvieron de los pacientes antes de la cirugía de diversos hospitales de Sydney y se colocan en almacenamiento a -80 ° C.
1. Pequeño aislamiento de ARN a partir de suero
El ARN total se preparó a partir de suero humano usando una versión modificada del protocolo de LS Tri-Reactivo RT.
- Descongelar la muestra de suero congelado en hielo y luego transferir 400 l de suero recién descongelado en un tubo de microcentrífuga etiquetado.
- Diluir el suero con 100 l de RNasa H 2 O y libre de agregar proteinasa K a una concentración de 1 mg / ml.
- Incubar a 37 ° C durante 20 minutos para permitir la digestión de la proteína por la proteinasa K.
- To asegurar la completa solubilización, añadir 1,5 veces su volumen de Tri-Reactivo RT LS y 100 l de 4-bromoanisol.
- Brevemente invertir el homogeneizado, realice pipeteo repetitivo durante 5 segundos y transferir a un tubo de 2 ml pesada cerradura de la fase etiquetada.
- Haga girar el homogeneizado a 12.000 × g durante 20 min a 4 ° C.
- Decantar cuidadosamente al menos 1 ml de la solución acuosa resultante en un tubo de ADN LoBind fresco. La interfase orgánica y debe ser atrapado debajo el gel blanco del tubo de cerradura de la fase.
- Añadir 5,0 l de glucógeno (5 mg / ml) y 500 l de isopropanol al 100% a la solución acuosa, mezclar por inversión e incubar O / N a -20 ° C.
- Después de O / N de incubación, centrífuga la muestra durante 20 min a 12.000 x g en una centrífuga de 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante claro y efectuar un lanzamiento "flash" durante 2 minutos a 16.000 xg en un 4 ° C centrífuga.
- Retire con cuidado el sol clarolución que rodea el sedimento usando una pipeta.
- Lavar el pellet con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga a 10.000 × g durante 10 min. Decantar la solución de lavado y repetir el paso de lavado.
2. ARN resuspensión en solución
- Resuspender el precipitado en 10 l de RNasa H 2 O libre, asegurando el sedimento se disolvió completamente. Para garantizar que el ARN se solubiliza completamente la muestra se puede calentar a 55 ° C durante 5 min. Durante este tiempo, la mezcla de la muestra con pipeteo repetido. Para un mayor rendimiento total de ARN, aunar dos preparaciones de ARN de la misma paciente.
- Cuantificar el ARN se resuspendió utilizando un espectrofotómetro UV-Vis y evaluar la calidad del ARN utilizando un 2100 Bioanalyzer. Almacenar las muestras de ARN agrupados a -80 ° C para su uso en aplicaciones posteriores.
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Representative Results
La figura 1 representa un típico espectro UV / Vis de ARN aislado a partir de suero. A partir de este perfil notamos la contaminación de proteínas a 280 nm con fenol y contaminantes orgánicos tanto a 270 nm y 230 nm, respectivamente. Residuo guanidinio tiocianato También se observó a 260 nm. Para reducir los contaminantes, se realizaron una serie de pasos de optimización para el procedimiento de RT-LS estándar de Tri-reactivo. Añadimos 5 mg / ml de glucógeno para aumentar tanto el rendimiento total de ARN y reducir la contaminación (line negro, la figura 1A).
Además se observó que después de la eliminación de isopropanol había aproximadamente 100-300 l de tampón de lavado que rodea el sedimento de ARN. Un giro centrífuga adicional esta en el protocolo y la solución de lavado residuo se retira cuidadosamente. Esto resultó en un cambio de perfil de 270 nm a 280 nm (trazo rojo, Figura 1B). Hemos deducido que este giro "flash" se había reducido la contaminación de fenola 270 nm y llegó a la conclusión de que el pico de 280 nm más probable representada la contaminación de proteínas.
Para aumentar aún más el rendimiento y reducir el RNA de transporte de proteínas a través añadimos un paso Gel de bloqueo de fase. Este paso permitió la transferencia completa de la fase acuosa y sin contaminantes orgánicos (Figura 1B). Como el suero contiene una gran cantidad de proteínas, se evaluó si la dilución del volumen de suero original habría ninguna diferencia (Figura 1C). En un volumen de extracto total de 500 l, mezclamos 400 y 250 l de suero con dH 2 O. El rendimiento de volumen más grande casi se duplicó la cantidad de ARN total cuando se compara con el uso de 250 l de suero. También hubo una reducción en contaminantes al disminuir el volumen de partida (Nota: Como la única variable en esta etapa de optimización fue el volumen de suero, el pico de 230 nm se asocia directamente con volúmenes de suero y no un artefacto de la aislamiento de Tri-reactivo) . A continuación, se evaluó el contenido de ARN pequeño de estos preparados usando el Bioanalyzer en combinación con el kit de ARN pequeño. A partir del trazado Bioanalyzer, hay un pico distinto a aproximadamente 20 NTS que representa la población de microARN (Figura 2A). El uso de este protocolo, este componente microRNA representó el 93% de la población total de los pequeños ARN. Este es un alto nivel de pureza y el ARN total se puede utilizar ahora para variar ensayos moleculares tales como matrices y reacciones de qPCR. Un resumen del flujo de trabajo se presenta en la Figura 2B.
Luego mide la expresión de microARN en cuatro muestras biológicas diferentes utilizando una matriz de oligonucleótidos o qPCR. Figura 3A representa un mapa de calor de microARN de estas cuatro muestras. Al igual que en nuestro estudio anterior, se utilizó la agrupación jerárquica para analizar la expresión de datos y muestras de grupos en función de su perfil de expresión de microARN 8. CuantitativoPCR (qPCR) también se utilizó para evaluar los niveles de microARN en estas preparaciones. Utilizando las mismas cuatro muestras, se realizó reacciones TaqMan qPCR singleplex para detectar miR-21-5p, miR-486-5p, miR-15b-5p, miR-16-5p y let-7a. Como se muestra en las gráficas de amplificación (Figuras 3B y 3C) se detectaron con éxito todos los miRNAs.
Figura 1. Perfil espectrofotométrico de ARN a partir de suero humano. A. Un perfil UV típico de ARN aislado de suero humano (línea azul). Varios pasos de optimización se ensayaron para reducir los contaminantes y aumentar el rendimiento de ARN total. B. compara el uso de un gel de bloqueo de fase a un aislamiento normal. C. Perfil de dos mediciones con diferentes volúmenes de partida de suero. Incrementar el volumen h ad marcado impacto en los rendimientos de ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. A. Representante Bioanalyzer traza mostrando un solo pico a aproximadamente 21 nucleótidos (eje x). Este pico representa la fracción de miRNA en la pequeña población de ARN a partir de suero. B. Resumen del flujo de trabajo para aislar el ARN total a partir de suero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Los microRNAs aislados mediante este método se utiliza para crear perfiles de matriz y análisis qPCR. Se aislaron A. Tres tipos de cáncer de cabeza y cuello y un sueros normales de ARN total (incluyendo los microRNAs) y se sometieron a la matriz de perfiles usando el chip de 8 X 60K miARN. Esto se repitió en repeticiones técnica. Después del control de calidad de datos en bruto (QC) de procesamiento, se analizó la expresión de estos microRNAs utilizando la agrupación jerárquica (HCL) y se presenta como un mapa de calor. El rojo indica que hasta la regulación y el azul indica en la regulación de los microRNAs. Curvas de amplificación B. Representante qPCR para la detección de miR-21, miR-486, miR-15, miR-16 y let-7a en cuatro sueros humanos. C. Todos cinco miRNAs se detectaron y los valores de Ct primas se representan a continuación para el suero normal. Este patrón de detección fue similar para las otras tres muestras (datos no mostrados)..jove.com/files/ftp_upload/51443/51443fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La población de microRNAs constituye aproximadamente el 0,4 a 0,5% del total de ARN que se encuentra en el suero. Además también hay un alto contenido de proteína que se encuentra en el suero humano. Para mejorar ARN y reducir tanto la proteína y fenol contamina hemos modificado el enfoque tradicional Chomczynski 9 con la adición de varios pasos.
El ARN total se aisló a partir de suero utilizando el estándar de Tri-reactivo de RT-LS (Molecular Research Centre) sin embargo cuando se realiza en nuestro laboratorio, este método produjo ARN en cantidades bajas con diversos contaminantes.
La figura 1 muestra un perfil de ARN espectrofotométrico UV con evidencia de contaminación de proteína a 280 nm, la contaminación de fenol a 270 nm, y otros contaminantes orgánicos a 230 nm. El reactivo, tiocianato de guanidinio, también se detectó a 260 nm.
Para abordar los problemas de los rendimientos de ARN séricas bajas y reducir la contaminación, una serie de Optimizatpasos de iones se añadieron al procedimiento de RT-LS estándar de Tri-reactivo. En primer lugar, se encontró que la dilución del suero 1 en 5 reducida la contaminación de proteínas. Este paso ha sido recomendado por otros estudios de 10 y se ha demostrado para reducir la contaminación de proteínas. Además, se utilizó una concentración de 1 mg / ml de proteinasa K. Habíamos probado un rango de concentraciones de 100, 500, y 1000 g. No hubo diferencia entre las concentraciones de este modo se utilizó concentraciones más elevadas y períodos de incubación más cortos.
La segunda modificación consistió en introducir el uso de los tubos de la Fase Lock 2.0 ml. La pesada del gel de bloqueo de fase atrapa la mayoría de los contaminantes tales como fenol y proteínas en la fase orgánica. Proporciona una barrera de densidad para la transferencia máxima de la fase acuosa y sin el riesgo de contaminación. La aplicación del gel de bloqueo de fase como un material acuoso / orgánico fase de barrera puede disminuir el tiempo de procesamiento y mejorar aún más recu ADNery por tanto como 30%, mientras que al mismo tiempo eliminar el usuario de la exposición a compuestos orgánicos volátiles nocivos 11. La tercera modificación dio lugar a una mejora considerable en la calidad del ARN. La introducción de un "flash" giro centrifugación a 12.000 x g era importante en la eliminación de cualquier contaminación residual a partir del sedimento de ARN antes de los lavados de etanol.
Cuando la comparación de nuestro enfoque a otras metodologías publicadas 6, 12, 13, hemos introducido el uso de un gel de bloqueo de fase para maximizar la recuperación de pequeños RNAs no codificantes de la fase acuosa. Una de las limitaciones de nuestro protocolo y los demás es que se pueden necesitar aislamientos replicadas para obtener suficiente ARN para el análisis de expresión. Desde nuestra experiencia, preferimos los métodos basados Trizol más de los kits basados en columnas y numerosos estudios han comparado los méritos de ambos sistemas de 6, 14-16. De particular interésfue un reciente estudio que concluyó que los miRNAs con bajo contenido de GC, como miR-141, miR-29b, miR-21, miR-106b, miR-15a y miR-34a, se pierden de forma selectiva durante la preparación de la muestra utilizando el método Trizol 17. Este problema fue resuelto por la adición de magnesio durante el aislamiento de la muestra.
En resumen, nuestro protocolo utiliza los métodos tradicionales para aislar ARN pequeños a partir de suero. Estos miRNAs de suero se pueden derivar de micro-partículas, exosomas o las células que mueren. Este protocolo sería aislar todos estos miRNAs para producir ARN de alta calidad que se puede utilizar para diversas aplicaciones moleculares aguas abajo. Este método de extracción es bastante sencillo, se basa en un hardware común que se encuentra en la mayoría de los laboratorios, y es lo suficientemente simple para la mayoría de los novatos interesados en la medición de la expresión de miRNAs en el suero humano.
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Samantha Khoury y Pamela Ajuyah son compatibles con el Premio de Postgrado de Australia. También nos gustaría agradecer la Red de Investigación Traslacional del Cáncer, Centro de Investigación del Cáncer de Lowy, Universidad de Nueva Gales del Sur y la Unidad de Investigación Traslacional de Cáncer del Norte por su apoyo adicional de Samantha Khoury.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Center, USA | TR 118 | |
| RNase free H2O | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | |
| Heavy Phase Lock tube | 5PRIME | 2302830 | 2 ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5 ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5 mg/ml |
| RNA grade isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated centrifuge | John Morris | ||
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| RNA grade ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent, USA |
References
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