טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי
Summary
אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.
Abstract
כאן אנו פירוט עיצוב, ייצור, ושימוש במכשיר microfluidic להעריך deformability של מספר רב של תאים בודדים באופן יעיל. בדרך כלל, נתונים ל~ 10 2 תאים ניתן לרכוש בתוך ניסוי שעה 1. תכנית ניתוח תמונה אוטומטית מאפשרת ניתוח שלאחר ניסוי יעיל של נתוני תמונה, המאפשר עיבוד להיות שלם בתוך כמה שעות. הגיאומטריה המכשיר שלנו היא ייחודית בכך שתאים חייבים לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה, ובכך לאפשר את העיוות הראשונית והרפיה של תאים בודדים תלוי זמן להיות assayed. תחולתה של שיטה זו לוקמיה פרומיילוציטית (HL-60) התאים באה לידי ביטוי. נהיגה תאים לעוות דרך אילוצי מיקרון בקנה מידה באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ, אנו צופים כי פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים לרגע לחסום את ההתכווצות הראשונה לזמן החציוני של 9.3 אלפיות שניים לפני passaging במהירות רב יותר דרך להצר הבאיונים עם זמן מעבר החציוני של 4.0 אלפיות שניים להתכווצות. בניגוד לכך, (נויטרופילים סוג) שטופל בחומצה רטינואית כל טרנס HL-60 תאים לחסום את ההתכווצות הראשונה רק 4.3 אלפית שניים לפני passaging דרך האילוצים שלאחר מכן עם זמן מעבר החציוני של 3.3 אלפיות שניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טבע viscoelastic של תאים, וסופו של דבר לחשוף את המקורות המולקולריים של התנהגות זו.
Introduction
שינויים בצורת תא הם קריטיים בהקשרים ביולוגיים רבים. לדוגמא, אריתרוציטים ולויקוציטים לעוות דרך נימים שהם קטנים יותר מאשר הקוטר שלהם 1. בגרורות, תאים סרטניים חייבים לעוות דרך פערים צרים ביניים, כמו גם כלי דם מפותלים ורשתות הלימפה זרע באתרים משניים 2. כדי לחקור את ההתנהגות הפיסית של תאים בודדים, מכשירי microfluidic להציג פלטפורמה אידיאלית שיכול להיות מותאם אישית כדי ללמוד מגוון רחב של התנהגויות תאים הכוללים את היכולת שלהם להעביר דרך צרים פערים 3 ולעוות באופן פסיבי באמצעות אילוצי מיקרון בקנה מידה 3 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירי microfluidic הם שקופים אופטי, המאפשרים לעיוותי תא להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור ונותחו באמצעות כלים לעיבוד תמונה בסיסיים. יתר על כן, מערכים של אילוצים יכולים להיות מוגדרים במדויק, המאפשרים ניתוח של תאים מרובים בו זמנית עםתפוקה שעולה על טכניקות קיימות רבות 10,11.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט לבדיקת deformability תא באמצעות מכשיר microfluidic PDMS 'תא deformer'. המכשיר תוכנן כך שמעבר תאים דרך אילוצים רציפים; גיאומטריה זו היא נפוצה בהקשרים פיסיולוגיים, כגון נימי ריאתי למיטה 12. כדי לאמוד את deformability תא, זמן מעבר מספק מטרי נוחה שנמדד בקלות את הזמן הנדרש לתא יחיד למעבר דרך 4,6 התכווצות אחת. כדי לשמור על ירידה בלחץ קבועה על פני הערוצים המכווצים בזמן מעבר תא, אנו משתמשים בזרימה מונע לחץ. הפרוטוקול שלנו כולל הוראות מפורטות על עיצוב מכשיר וייצור, תפעול מכשיר על ידי-לחץ מונע זרימה, הכנה והדמיה של תאים, כמו גם עיבוד תמונה כדי למדוד את הזמן לתאים כדי לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות. אנו כולליםשני עיצובי מכשיר וקוד עיבוד נתונים חזון כקבצים משלימים. כמדגם מייצג של נתונים, אנו מראים את הזמן מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות כפונקציה של מספר האילוצים passaged. ניתוח של לוח הזמנים לתאים למעבר למרות אילוצים צרים של מכשיר microfluidic יכול לחשוף הבדלים בdeformability של מגוון רחב של סוגי תאים 4,5,13. המכשיר הפגין כאן באופן ייחודי סוקר מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה; עיצוב זה מחקה את הדרך המפותלת שתאים חווים במחזור וגם מאפשרים חיטוט מאפיינים פיזיים נוספים של התאים כגון זמן הרפיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים הליך ניסיוני מקיף לניתוח העיוות של תאים העוברים דרך ערוצי microfluidic מכווצים באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ. תסריט MATLAB מאפשר עיבוד נתונים אוטומטי (משלימה חומר); גרסה מעודכנת של הקוד נשמר (www.ibp.ucla.edu/research/rowat). באופן רחב יות…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לויד Ung עבור קלט קונסטרוקטיבי בגרסאות המוקדמות של טכניקה זו, ד"ר ג'רמי Agresti לטיפים לעיצוב כובע לחץ, וד"ר Dongping צ'י על עזרתו בבודת כובע הלחץ. אנו מודים למעבדות של מ 'Teitell ופ Gunaratne למתן מגוון רחב של דגימות תאים לבדיקה. אנו מודים לקרן הלאומית למדע (קריירת פרס DBI-1,254,185), המרכז לסרטן באוניברסיטת UCLA Jonsson, וUCLA הקליני וTranslational Science Institute לתמיכה בעבודה זו.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
Referências
- Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
- Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
- Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).
- Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).
- Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).
- Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
- Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
- Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
- Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
- Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
- Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
- Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
- Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
- Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
- Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
- Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
- Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
