Una técnica de microfluidos investigará Deformabilidad Cell
Summary
Se demuestra un ensayo basado en microfluídica para medir la escala de tiempo de tránsito para las células a través de una secuencia de constricciones a escala micrométrica.
Abstract
Aquí nos detalle el diseño, fabricación y uso de un dispositivo de microfluidos para evaluar la deformabilidad de un gran número de células individuales de una manera eficiente. Típicamente, los datos de ~ 10 2 células pueden ser adquiridos dentro de un experimento 1 hr. Un programa de análisis de imagen automatizado permite eficiente análisis post-experimento de datos de imagen, lo que permite el procesamiento de estar completo dentro de unas pocas horas. Nuestra geometría del dispositivo es único en que las células deben deformarse a través de una serie de constricciones a escala micrométrica, permitiendo de ese modo la deformación inicial y la relajación dependiente del tiempo de las células individuales a ensayar. La aplicabilidad de este método a las células de leucemia promielocítica humana (HL-60) se demuestra. Células de conducción para deformar través constricciones micras escala que utilizan flujo de presión impulsada, observamos que (HL-60) células promielocítica humana momentáneamente ocluyen la primera constricción de un tiempo medio de 9,3 ms antes de pases con mayor rapidez a través de la constricción posterioriones con un tiempo de tránsito promedio de 4,0 milisegundos por constricción. Por el contrario, todo-trans tratado con ácido (tipo de neutrófilos) retinoico células HL-60 ocluyen la primera constricción sólo 4,3 mseg antes de pases a través de las constricciones posteriores con un tiempo de tránsito mediana de 3,3 mseg. Este método puede dar una idea de la naturaleza viscoelástica de células, y finalmente revelar los orígenes moleculares de este comportamiento.
Introduction
Los cambios en la forma celular son fundamentales en numerosos contextos biológicos. Por ejemplo, los eritrocitos y los leucocitos se deforman través de los capilares que son menores que su propio diámetro 1. En la metástasis, las células cancerosas deben deformarse a través de huecos intersticiales estrechas, así como la vasculatura tortuosa y redes linfáticos para sembrar en sitios secundarios 2. Para investigar el comportamiento físico de las células individuales, dispositivos de microfluidos presentan una plataforma ideal que se puede personalizar para estudiar una serie de comportamientos celulares, incluyendo su capacidad de migrar a través de huecos estrecho 3 y deformar pasivamente a través de las constricciones de escala micrométrica 3- 9. Polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivos de microfluidos son ópticamente transparentes, permitiendo deformaciones celulares para ser visualizadas mediante microscopía de luz y analizados utilizando herramientas básicas de procesamiento de imágenes. Además, las matrices de constricciones pueden ser definidos con precisión, que permite el análisis de múltiples células simultáneamente con unarendimiento que supera muchas técnicas existentes 10,11.
Aquí se presenta un protocolo experimental detallado para sondear deformabilidad celular utilizando el dispositivo de microfluidos 'Cell Deformador' PDMS. El dispositivo está diseñado de manera que las células de paso a través de constricciones secuenciales; esta geometría es común en contextos fisiológicos, tales como el lecho capilar pulmonar 12. Para medir la deformabilidad celular, el tiempo de tránsito proporciona una métrica conveniente que se mide fácilmente como el tiempo requerido para una célula individual a través de un único tránsito 4,6 constricción. Para mantener una caída de presión constante a través de los canales estrechos durante el tránsito de células, usamos flujo accionado por presión. Nuestro protocolo incluye instrucciones detalladas sobre el diseño del dispositivo y la fabricación, el funcionamiento del dispositivo de flujo impulsado por presión, la preparación y obtención de imágenes de células, así como el procesamiento de imágenes para medir el tiempo para que las células se deforman a través de una serie de constricciones. Incluimosambos diseños de dispositivos y el código de procesamiento de datos como archivos de visión suplementarios. Como una muestra representativa de los datos, se muestra el tiempo de tránsito celular a través de una serie de constricciones como una función del número de constricciones pases. Análisis de la escala de tiempo para que las células tránsito a través constricciones estrechos de un dispositivo de microfluidos puede revelar diferencias en la deformabilidad de una variedad de tipos de células 4,5,13. El dispositivo ha demostrado aquí examina únicamente el tránsito celular a través de una serie de constricciones a escala micrométrica; este diseño emula el tortuoso camino que las células experimentan en circulación y también permite sondear las características físicas adicionales de las células, tales como tiempo de relajación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí proporcionamos un procedimiento experimental global para el análisis de la deformación de las células que transitan a través de canales de microfluidos obstruida usando flujo de presión impulsada. Una secuencia de comandos de MATLAB permite el procesamiento automático de datos (material complementario); se mantiene una versión actualizada del código ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). En términos más generales, las técnicas presentadas aquí…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer Lloyd Ung de aportación constructiva en las primeras versiones de esta técnica, el Dr. Jeremy Agresti para tapa de presión consejos de diseño, y el Dr. Dongping Qi por su ayuda en la fabricación de la tapa de presión. Estamos muy agradecidos a los laboratorios de M. Teitell y P. Gunaratne para proporcionar una variedad de muestras de células para la prueba. Estamos muy agradecidos a la Fundación Nacional para la Ciencia (CARRERA Premio DBI-1254185), el Centro Integral del Cáncer Jonsson de la UCLA, y la UCLA Clínica y Translational Science Institute para apoyar este trabajo.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
Referências
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