Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare
Summary
Dimostriamo un saggio basato microfluidica-per misurare i tempi di cellule di transitare attraverso una sequenza di costrizioni micron scala.
Abstract
Qui noi dettaglio la progettazione, la fabbricazione e l'uso di un dispositivo di microfluidica per valutare la deformabilità di un gran numero di singole cellule in modo efficiente. In genere, i dati per ~ 10 2 cellule possono essere acquisite all'interno di un esperimento di 1 ora. Un programma di analisi delle immagini automatizzata consente efficiente analisi post-esperimento dei dati di immagine, consentendo l'elaborazione di essere completo entro poche ore. La geometria del dispositivo è unico in quanto le cellule devono deformare attraverso una serie di costrizioni micron scala, consentendo in tal modo la deformazione iniziale e rilassamento dipendente dal tempo di singole cellule da dosare. L'applicabilità di questo metodo per leucemia promielocitica umana (HL-60), le cellule è dimostrata. Cellule Guidando a deformarsi attraverso costrizioni micron scala usando flow-driven pressione, osserviamo che promielocitica umana (HL-60) le cellule momentaneamente occludono la prima costrizione per un tempo mediano di 9,3 msec prima passaging più rapidamente attraverso la successiva costrizioneioni con un tempo di transito medio di 4,0 msec per costrizione. Al contrario, tutto-trans retinoico trattati con acido (neutrofili-tipo) cellule HL-60 occludono la prima costrizione per soli 4.3 msec prima passaging attraverso le strettoie successivi con un tempo di transito medio di 3,3 msec. Questo metodo può fornire indicazioni sulla natura viscoelastica di cellule, e in ultima analisi rivelano le origini molecolari di questo comportamento.
Introduction
Le variazioni di forma delle cellule sono fondamentali in numerosi contesti biologici. Ad esempio, eritrociti e leucociti deformano attraverso capillari che sono più piccoli di loro diametro 1. In metastasi, le cellule tumorali devono deformare attraverso spazi interstiziali stretti così come vascolare tortuoso e le reti linfatiche per seminare nei siti secondari 2. Per sondare il comportamento fisico delle singole cellule, dispositivi microfluidici presentano una piattaforma ideale che può essere personalizzato per studiare una serie di comportamenti cellulari tra cui la loro capacità di migrare attraverso strette fessure 3 e deformare passivamente attraverso costrizioni micron scala 3- 9. Polidimetilsilossano (PDMS) dispositivi microfluidici sono otticamente trasparente, consentendo deformazioni cellulari per essere osservata con un microscopio ottico e analizzati utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini di base. Inoltre, le matrici di costrizioni possono essere definite con precisione, consentendo l'analisi di più celle contemporaneamente conrendimento che supera molte tecniche esistenti 10,11.
Qui vi presentiamo un piano sperimentale dettagliato per sondare deformabilità cellulare utilizzando il dispositivo di microfluidica 'cellulare Deformatore' PDMS. Il dispositivo è progettato in modo che le cellule passaggio attraverso costrizioni sequenziali; questa geometria è comune in contesti fisiologici, come il capillare polmonare letto 12. Per misurare la deformabilità delle cellule, il tempo di transito fornisce una metrica conveniente che è facilmente misurato come il tempo richiesto per una singola cella di transito attraverso un'unica 4,6 costrizione. Per mantenere una caduta di pressione costante su tutti i canali ristretti durante il trasporto delle cellule, usiamo il flusso di pressione-driven. Il nostro protocollo include istruzioni dettagliate sulla progettazione e fabbricazione del dispositivo, il funzionamento del dispositivo di pressione-driven flusso, la preparazione e l'imaging di cellule, così come l'elaborazione delle immagini per misurare il tempo per le celle a deformare attraverso una serie di costrizioni. Includiamoentrambi i modelli del dispositivo e codice di elaborazione dati di visione come file supplementari. Come un campione rappresentativo di dati, mostriamo tempo di transito cella attraverso una serie di costrizioni in funzione del numero di costrizioni diversi passaggi. Analisi dei tempi per celle di transitare se costrizioni strette di un dispositivo microfluidico può rivelare differenze di deformabilità di una varietà di tipi cellulari 4,5,13. Il dispositivo dimostrato qui sorveglia unicamente transito cella attraverso una serie di costrizioni micron scala; questo disegno emula il percorso tortuoso che le cellule vivono in circolazione e permette anche sondare le caratteristiche fisiche supplementari di cellule, come tempo di rilassamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui forniamo una procedura sperimentale completo per l'analisi della deformazione delle cellule che transitano attraverso i canali microfluidici ristretto con flusso pressione-driven. Uno script MATLAB consente l'elaborazione automatica dei dati (Supplemental materiale); di una versione aggiornata del codice è mantenuta ( www.ibp.ucla.edu/research/rowat ). Più in generale, le tecniche qui presentate possono essere adattati in molti saggi microfluidi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Lloyd Ung per l'input costruttivo nelle prime versioni di questa tecnica, il dottor Jeremy Agresti per le punte di design tappo a pressione, e il dottor Dongping Qi per il suo aiuto nella fabbricazione il tappo di pressione. Siamo grati ai laboratori di M. Teitell e P. Gunaratne per fornire una varietà di campioni di cellule per il test. Siamo grati per la National Science Foundation (CARRIERA Premio DBI-1254185), la UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, e la UCLA clinica e traslazionale Science Institute per sostenere questo lavoro.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant | Fisher Scientific | 8409400 | Produced by BASF, also available through Sigma |
| PDMS base and crosslinker | Essex Brownell | DC-184-1.1 | Product commonly named Sylgard 184 Elastomer |
| Oxygen plasma discharge unit | Enercon | Dyne-A-Mite 3D Treater | |
| Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Fingertight Ferrule, 1/32" | Upchurch Scientific | UP-F-113 | |
| Fingertight III Fitting, 10-32 | Upchurch Scientific | UP-F-300X | |
| polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32"or 0.79 mm | Valco | TPK.515-25M | |
| polyethylene (PE-20) tubing, 0.043" or 1.09 mm | Becton Dickinson | 427406 | |
| Pressure regulator | Airgas or Praxair | ||
| Polyurethane tubing, 5/32” OD | McMaster Carr | 5648K284 | |
| Push-to-connect fittings | McMaster Carr | 5111K91 | |
| Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter | Omega | IP413-020 | |
| 16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ | National Instruments | NI PCI 6225-779295-01 | |
| Analog Connector Block-Screw Terminal | National Instruments | SCB-68-776844-01 | |
| LabView System Design Software | National Instruments | ||
| Matlab Software | The MathWorks, Inc. | Matlab R2012a | Code requires the Image Processing Toolbox |
| Shielded Cable | National Instruments | SHC68-68 |
Referências
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