Molecular Profiling van de invasieve tumor micro in een 3-dimensionaal model van colorectale kanker cellen en<em> Ex vivo</em> Fibroblasts
Summary
Moleculaire profilering van laser gemicrodissecteerde cellen en stroma van synthetische, weefselengineering darmkanker modellen vertegenwoordigt een nieuwe benadering en manipuleerbaar te karakteriseren en ontleden de kenmerkende biologie op het grensvlak tussen tumorcellen aan de voorzijde en invasieve kanker geassocieerd stromacellen.
Abstract
Binnenvallende colorectale kanker (CRC) cellen hebben het vermogen om los te breken uit hun zus cellen, infiltreren het stroma, en de vorm van de extracellulaire matrix (ECM) verworven. Karakteriseren van de biologie van deze fenotypisch verschillende groep cellen kan ons begrip van de vroege gebeurtenissen tijdens de metastatische cascade te verbeteren.
Tumor invasie is een dynamisch proces vergemakkelijkt door bidirectionele interactie tussen kwaadaardige epitheel en kanker-geassocieerde stroma. Om cel-specifieke antwoorden te onderzoeken op de tumor stroma-koppeling die we hebben organotypische co-cultuur en laser micro-dissectie technieken gecombineerd.
Organotypische modellen waarin belangrijke stromale bestanddelen zoals fibroblasten 3-dimentioanally samen gekweekt met kanker epitheelcellen, zeer manipuleerbaar experimentele instrumenten die invasie en kanker-stroma interacties kunnen worden onderzocht in het bijna physiological voorwaarden.
Laser microdissectie (LMD) is een techniek die de chirurgische dissectie en extractie van de verschillende lagen in tumorweefsel, met micron-niveau nauwkeurig meebrengt.
Door het combineren van deze technieken met genomic, transcriptomische en epigenetische profilering willen we een beter begrip van de moleculaire kenmerken van binnenvallende tumorcellen en stromale omliggende weefsel te ontwikkelen, en daarmee potentieel te onthullen nieuwe biomarkers en de mogelijkheden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen in CRC.
Introduction
Organotypische co-culturen zijn tissue-engineered modellen die helpen bij de wederopbouw van de in vivo tumormicromilieu in 3-dimensies door naast elkaar maligne epitheliale en stromale cellen in een collageen gel met essentiële extracellulaire matrix componenten 1-3. Voornamelijk opgevat als meetmethode tumorinvasie, organotypics minder afhankelijk van in vivo diermodellen, en voorkomen dat de tekortkomingen van andere in vitro technieken zoals Transwell assays, waarbij binnendringende cellen kunstmatig gedwongen tot een mono-gedispergeerde toestand 2-4. De opname van stromale cellen in deze modellen, zoals fibroblasten, weerspiegelt de essentiële rol van de tumor micro reguleren kwaadaardige invasie en metastase 3-4, maar de fenotypische heterogeniteit van het stroma zodanig dat om de fysiologische relevantie van organotypische maximaliseren modellen, orgaan-specifieke, anatomisch correcte ex vivofibroblasten moeten worden opgenomen waar mogelijk 3,6.
Organotypics zijn een veelzijdig platform om interactie tussen tumorcellen en stromale cellen te bestuderen en worden steeds meer gebruikt in nieuwe manieren om de impact op de tumor invasie van chemische remmers en gerichte gen 7,8 veranderingen te onderzoeken. Het bestuderen van de invasieve tumor marge is een bijzonder spannend vooruitzicht. In organotypische modellen vastgesteld colorectale kanker (CRC) cellijnen meestal een goed gestratificeerde epitheel laag en in dwarsdoorsnede, cellen die het vermogen om de extracellulaire matrix (ECM) binnendringen verworven zijn gemakkelijk te onderscheiden. In het licht van de micro-topografische heterogeniteit van tumoren en tumor geassocieerde stromale cellen in vivo, extraheren deze cellen via Laser microdissectie en het bestuderen ze afzonderlijk kunnen belangrijke biologische inzichten over het ontstaan van colorectale kanker metastase onthullen hoe efficiënter kan gericht. Ikn de volgende methode, alle patiënten die weefselmonsters gaven schriftelijk toestemming, en de studie geschonken werd goedgekeurd door de instellingen regionale-ethische toetsingscommissie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een methode om specifiek te isoleren en karakteriseren van tumorcellen die het vermogen om kanker geassocieerde stroma binnendringen in de vroegste stadia van metastatische progressie in een 3-dimensionale co-cultuur construct van epitheliale en stromale cellen verkregen.
Co-cultuur modellen uit CRC epitheelcellen afgewisseld met een synthetisch stroma die ex vivo humane colon fibroblasten werden gebruikt om CRC invasie studeren in 3 dimensies. Deze fysiologisch …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MB wordt ondersteund door subsidies van een MRC gemeenschap. KP en AHM worden ondersteund door subsidies van Wessex Medical Research en Cancer Research UK / RCS (Engeland) (C28503/A10013). Wij zijn dankbaar voor de steun van de Universiteit van Southampton Histochemistry Research Unit.
Materials
| Colorectal cancer cell lines – example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
Referências
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
