Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em> Ex vivo</em> Los fibroblastos

Summary

Las características moleculares de las células láser microdissected y estroma de, modelos de cáncer colorrectal ingeniería de tejidos sintéticos representa un enfoque novedoso y manipulable para caracterizar y diseccionar la biología distintiva en la interfaz entre las células tumorales en el cáncer de células del estroma asociado frente invasivo y.

Abstract

Invadir el cáncer colorrectal células (CRC) han adquirido la capacidad de liberarse de sus células hermanas, infiltrarse en el estroma, y ​​remodelar la matriz extracelular (ECM). La caracterización de la biología de este grupo fenotípicamente distintas de células podría mejorar sustancialmente nuestra comprensión de los eventos tempranos durante la cascada metastásica.

La invasión tumoral es un proceso dinámico facilitado por interacciones bidireccionales entre epitelio maligno y el estroma cáncer asociado. Con el fin de examinar las respuestas de células específicas en el estroma interfaz tumor hemos combinado co-cultivo y técnicas de micro-disección láser organotípico.

Modelos organotípicos, en el que los componentes del estroma clave tales como los fibroblastos son 3-dimentioanally co-cultivadas con células epiteliales cancerosas, son herramientas experimentales altamente manipulables que permiten la invasión y las interacciones con el cáncer del estroma para ser estudiados en casi phcondiciones ysiological.

Microdisección láser (LMD) es una técnica que implica la disección quirúrgica y la extracción de los diversos estratos dentro del tejido del tumor, con precisión nivel de micras.

Mediante la combinación de estas técnicas con el perfil genómico, transcriptómica y epigenética nos proponemos desarrollar una comprensión más profunda de las características moleculares de la invasión de las células del tumor y el tejido circundante del estroma, y ​​al hacerlo, potencialmente revelar nuevos biomarcadores y oportunidades para el desarrollo de fármacos en el CCR.

Introduction

Co-cultivos organotípicos son modelos de ingeniería tisular que ayuda en la reconstrucción del microambiente del tumor in vivo en en 3-dimensiones mediante la yuxtaposición de las células epiteliales malignas y células estromales en un gel de colágeno que contiene componentes de la matriz extracelular esenciales ^1-3. Principalmente concebido como un método de medición de la invasión tumoral, organotypics reducir la dependencia en modelos animales in vivo, y evitar las deficiencias de otras técnicas in vitro tales como ensayos Transwell, en el que las células invasoras se ven obligados artificialmente en un estado mono-dispersado ^2-4. La inclusión de las células del estroma en estos modelos, tales como fibroblastos, refleja el papel esencial de la microambiente del tumor en la regulación de la invasión maligna y metástasis ^3-4, sin embargo, la heterogeneidad fenotípica de la estroma es tal que con el fin de maximizar la relevancia fisiológica de organotípicos modelos, específica de órganos, de precisión anatómica ex vivofibroblastos deberían incluirse siempre que sea posible ^{de 3,6.}

Organotypics son una plataforma versátil para estudiar las interacciones entre el tumor y las células del estroma y se utilizan cada vez más en nuevas formas de examinar el impacto en la invasión tumoral de los inhibidores químicos y alteraciones genéticas específicas ^7,8. Estudiar el margen del tumor invasivo es una perspectiva particularmente emocionante. En los modelos organotípicos, cáncer colorrectal establecido (CRC) las líneas celulares se caracterizan por producir una capa epitelial bien estratificada, y en sección transversal, las células que han adquirido la capacidad de invadir la matriz extracelular (ECM) son fácilmente discernibles. A la luz de la heterogeneidad de micro-topográfico establecido de tumor y el tumor asociado células estromales in vivo, la extracción de estas células usando microdisección láser y el estudio de ellos en el aislamiento, puede revelar importantes conocimientos biológicos con respecto a los orígenes de la metástasis del cáncer colorrectal y cómo puede ser más eficiente apuntado. Yon la siguiente metodología, todos los pacientes que donaron muestras de tejidos por escrito el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por los comités de ética instituciones regionales de investigación.

Protocol

1. Establecimiento de cultivos de fibroblastos primarios de colon explantes Obtener muestras de tejido normal de la mucosa del colon humano directamente de la sala de operaciones quirúrgica, y suspender en 7-10 ml de PBS suplementado con 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 0,25 mg / ml de Fungizone. En el laboratorio, colocar la muestra en el centro de un 10 cm de placa de cultivo tisular y lavar 3 veces con PBS / Pen-Strep / Fungizone. No aspirar después del último …

Representative Results

Hemos aplicado el método anterior para múltiples combinaciones de líneas celulares de CRC y células del estroma. Un ejemplo que se presenta aquí es las líneas de células SW480 epitelial CRC con ex vivo fibroblastos primarios de colon humano. Co-cultivos 3-dimensionales se construyen (Figura 1), se sometieron a microscopía de láser y microdisección de captura (Figura 2), y se analizaron por microARN (miARN) de perfiles (Figura 3) para la comparación d…

Discussion

Aquí se describe un método para aislar y caracterizar las células tumorales que han adquirido la capacidad de invadir el estroma asociado cáncer durante las primeras etapas de la progresión metastásica en un constructo de co-cultivo de 3 dimensiones de células epiteliales y estromales específicamente.

Se utilizaron modelos de co-cultivo formadas por células epiteliales CRC yuxtapuestos con un estroma sintética que contiene ex vivo fibroblastos colon humano para estudiar la…

Materials

Colorectal cancer cell lines – example shown SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Collagen	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Nylon membrane	Merck Millipore	VVLP01300
Metal grid	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
Laser microdissection platform	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Membrane mounted slides	Molecular devices
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025