Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e<em> Ex vivo</em> fibroblasti

Summary

Profiling molecolare delle cellule laser microdissezione e da stroma, modelli di cancro colorettale tissutale sintesi rappresenta un approccio nuovo e manipolabile per caratterizzare e sezionare la biologia distintivo all'interfaccia tra cellule tumorali al fronte invasivo e cancro associato cellule stromali.

Abstract

Invadere il cancro colorettale (CRC), le cellule hanno acquisito la capacità di liberarsi dalle loro celle sorelle, infiltrare lo stroma, e rimodellare la matrice extracellulare (ECM). Caratterizzare la biologia di questo gruppo fenotipicamente distinto di cellule potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione di eventi precoci durante la cascata metastatica.

Invasione tumorale è un processo dinamico facilitato dalle interazioni bidirezionali tra epitelio maligno e lo stroma cancro associato. Al fine di esaminare le risposte specifiche cellule al stroma-interfaccia tumore abbiamo combinato organotipica co-coltura e laser tecniche di micro-dissezione.

Modelli organotipica, in cui componenti stromali chiave come i fibroblasti sono 3 dimentioanally co-coltura con cellule epiteliali tumorali, sono strumenti sperimentali altamente manipolabile che consentono l'invasione e le interazioni tumore-stroma da studiare in near-phcondizioni ysiological.

Laser microdissezione (LMD) è una tecnica che comporta la dissezione chirurgica ed estrazione dei vari strati all'interno del tessuto tumorale, con precisione di micron.

Combinando queste tecniche con la genomica, trascrittomica e epigenetica profiling puntiamo a sviluppare una comprensione più profonda delle caratteristiche molecolari di invadere le cellule tumorali e circostante tessuto stromale, e in tal modo potenzialmente rivelare nuovi biomarcatori e opportunità per lo sviluppo di farmaci in CRC.

Introduction

Co-colture organotipiche sono modelli tissutale che aiutano a ricostruire in vivo microambiente tumorale in 3-dimensioni per giustapposizione di cellule epiteliali maligne e cellule stromali in un gel di collagene contenente componenti essenziali della matrice extracellulare ^1-3. Principalmente concepito come un metodo per misurare invasione tumorale, organotypics ridurre la dipendenza da modelli animali in vivo, ed evitare le lacune di altre tecniche in vitro come saggi Transwell, in cui le cellule invasori sono costretti artificialmente in uno stato mono-disperso ^2-4. L'inclusione di cellule stromali in questi modelli, quali fibroblasti, riflette il ruolo essenziale del microambiente tumorale maligna nella regolazione invasione e metastasi ^3-4, tuttavia l'eterogeneità fenotipica dello stroma è tale che, al fine di massimizzare la rilevanza fisiologica di organotipico modelli, organo specifico, anatomicamente accurati ex vivofibroblasti dovrebbero essere inclusi ove possibile ^3,6.

Organotypics sono una piattaforma versatile per studiare le interazioni tra tumore e le cellule stromali e sono sempre più utilizzati in nuovi modi per esaminare l'impatto sulla invasione tumorale di inibitori chimici e le alterazioni geniche mirate ^7,8. Studiare il margine di tumore invasivo è una prospettiva particolarmente emozionante. In modelli organotipici, cancro colorettale fissato (CRC) linee cellulari producono tipicamente uno strato epiteliale ben stratificato, in sezione trasversale, le cellule che hanno acquisito la capacità di invadere la matrice extracellulare (ECM) sono facilmente distinguibili. Alla luce della eterogeneità micro-topografica consolidata di tumore e tumore associato cellule stromali in vivo, estrazione di queste cellule mediante microdissezione laser e studiare isolatamente, può rivelare importanti informazioni biologiche riguardanti le origini del colon-retto metastasi del cancro e come può essere più efficiente mirato. Ion la seguente metodologia, tutti i pazienti che hanno donato campioni di tessuto fornite per iscritto il consenso informato, e lo studio è stato approvato dalle istituzioni del comitato etico di ricerca regionali.

Protocol

1. Istituzione di primaria fibroblasti culture da colon espianti Ottenere campioni di tessuto normale del colon umano mucosa direttamente dalla sala operatoria chirurgica, e sospendere in 7-10 ml di PBS completato con 100 unità / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, e 0,25 mg / ml Fungizone. In laboratorio, porre il campione al centro di 10 cm piatto di coltura tissutale e lavare 3 volte con PBS / Pen-strep / Fungizone. Non aspirare dopo il lavaggio finale. Con pinze sterili e bi…

Representative Results

Abbiamo applicato il metodo di cui sopra per più combinazioni di linee cellulari e cellule stromali CRC. Un esempio qui presentato è linee cellulari epiteliali SW480 CRC con ex vivo fibroblasti umani primari del colon. Co-colture 3-dimensionali sono costruiti (Figura 1), sottoposto alla microscopia e cattura microdissezione laser (Figura 2), e analizzati mediante microRNA (miRNA) profiling (Figura 3) per il confronto dei miRNA differenzialmente espressi tra c…

Discussion

Qui si descrive un metodo per isolare e caratterizzare specificamente le cellule tumorali che hanno acquisito la capacità di invadere il cancro stroma associato durante le prime fasi della progressione metastatica in un 3-dimensionale di co-coltura costrutto delle cellule epiteliali e stromali.

Modelli di co-coltura costituiti da cellule epiteliali CRC giustapposti con una stroma sintetico contenente ex vivo fibroblasti umano del colon sono stati usati per studiare CRC invasione in…

Materials

Colorectal cancer cell lines – example shown SW480	ATCC	ATCC CCL-228
Collagen	BD Biosciences	354265
Matrigel	BD Biosciences	354234
Nylon membrane	Merck Millipore	VVLP01300
Metal grid	The Mesh Company	WSS20-A4	themeshcompany.com
Laser microdissection platform	Leica Microsystems	Leica AS LMD
Membrane mounted slides	Molecular devices
Cresyl Violet	Merck Millipore	1052350025