מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em> Ex vivo</em> פיברובלסטים
Summary
פרופיל מולקולרי של תאי לייזר microdissected וstroma ממודלים סינטטיים, רקמות מהונדסות סרטן מעי גס מייצג רומן גישה למניפולציה כדי לאפיין ולנתח את הביולוגיה הייחודית בממשק שבין תאים סרטניים בחזית פולשנית ותאי סטרומה סרטן קשור.
Abstract
פלישה לסרטן מעי גס תאים (CRC) רכשו את היכולת להשתחרר מתאי אחותם, לחדור stroma, ולשפץ את מטריצת החוץ תאית (ECM). אפיון הביולוגיה של קבוצת phenotypically מובחנת זו של תאים יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של אירועים המוקדמים שלנו במפל גרורתי.
פלישת גידול היא תהליך דינמי בהנחייתם של אינטראקציות דו כיוונית בין האפיתל הממאיר וstroma הסרטן קשור. על מנת לבחון את תגובות תא ספציפי בstroma ממשק גידול יש לנו שילוב organotypic תרבות משותפת וטכניקות מיקרו לנתיחה בלייזר.
מודלים Organotypic, שבו בוחרי סטרומה מפתח כגון fibroblasts הם 3-dimentioanally שיתוף תרבותי עם תאי האפיתל בסרטן, הם כלים ניסיוניים למניפולציה מאוד אשר יאפשר פלישה ואינטראקציות הסרטן stroma להיחקר בכמעט phתנאי ysiological.
microdissection הלייזר (LMD) הוא טכניקה שכרוכה נתיחה כירורגית וחילוץ של השכבות השונות בתוך רקמת גידול, עם דיוק ברמת מיקרון.
על ידי שילוב של טכניקות אלה עם פרופיל גנומי, transcriptomic ואפיגנטיים אנו שואפים לפתח הבנה עמוקה יותר של המאפיינים המולקולריים של פולשים לתאי גידול ורקמה מסביבו סטרומה, ותוך כדי כך שעלול לחשוף סמנים ביולוגיים והזדמנויות לפיתוח תרופה בCRC רומן.
Introduction
שיתוף תרבויות Organotypic דגמי רקמות מהונדסות אשר מסייע בשחזור in vivo microenvironment הגידול ב3 ממדים על ידי הפוצעים תאי האפיתל ממאירים ותאי סטרומה בג'ל קולגן המכיל רכיבי מטריצה תאית חיוניים 1-3. בעיקר נתפס כשיטת מדידת פלישת גידול, organotypics להפחית את התלות בin vivo מודלים של בעלי חיים, ולמנוע את החסרונות של טכניקות במבחנה אחרות כגון מבחני Transwell, שבו תאים פולשים נאלצים באופן מלאכותי למצב פיזור מונו 2-4. הכללתם של תאי סטרומה במודלים אלה, כגון fibroblasts, משקף את התפקיד החיוני של microenvironment הגידול בויסות פלישה גרורה 3-4 ממאירים, לעומת זאת ההטרוגניות פנוטיפי של stroma היא כזה שעל מנת למקסם את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של organotypic מודלים, ספציפי איבר, מדויק מבחינה אנטומית vivo לשעבריש לכלול fibroblasts בכל מקום אפשרי 3,6.
Organotypics הוא פלטפורמה מגוונת כדי לחקור אינטראקציות בין סרטניים ותאי סטרומה ומשמש יותר ויותר בדרכים חדשות כדי לבחון את ההשפעה על פלישת גידול של מעכבים כימיים ושינויי גן ממוקדים 7,8. לומד את שיעור גידול החודרני הוא סיכוי מרגש במיוחד. בדגמי organotypic, שורות תאי סרטן מעי גס שהוקם (CRC) בדרך כלל מייצרות שכבת האפיתל גם מרובד, ובחתך, תאים שרכשו את היכולת לפלוש למטריצה תאית (ECM) בקלות לעין. לאור ההטרוגניות הוקמה מיקרו הטופוגרפי של גידול ותאי סטרומה גידול קשור in vivo, הוצאת תאים אלה באמצעות microdissection לייזר ולומד אותם בבידוד, עשוי לחשוף תובנות ביולוגיות חשובות הנוגעות למקורות של גרורות סרטן מעי גס, ואיך זה יכול להיות בצורה יעילה יותר ממוקד. אניn המתודולוגיה הבאה, כל החולים שתרמו דגימות רקמה הניתנות בכתב הסכמה מדעת, והמחקר אושר על ידי ועדת אתיקה מוסדות מחקר האזורית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה לבודד באופן ספציפי ולאפיין תאים סרטניים אשר רכשו את היכולת לפלוש stroma הקשורים לסרטן בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות גרורתי במבנה תרבות משותפת 3 ממדים של תאי אפיתל וסטרומה.
מודלים שיתוף התרבות מורכבים מתאי אפי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MB נתמך על ידי מימון מענק ממלגת MRC. KP וAHM נתמכים על ידי מימון מענק ממחקר רפואי וסקס וחקר הסרטן בבריטניה / RCS (אנגליה) (C28503/A10013). אנו אסירי תודה על התמיכה של אוניברסיטת סאות'המפטון היסטוכימיה יחידת מחקר.
Materials
| Colorectal cancer cell lines – example shown SW480 | ATCC | ATCC CCL-228 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354265 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Nylon membrane | Merck Millipore | VVLP01300 | |
| Metal grid | The Mesh Company | WSS20-A4 | themeshcompany.com |
| Laser microdissection platform | Leica Microsystems | Leica AS LMD | |
| Membrane mounted slides | Molecular devices | ||
| Cresyl Violet | Merck Millipore | 1052350025 |
Referências
- Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Zhang, L., et al. miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance. Cancer Res. , (2013).
- Bullock, M. D., et al. Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression. Cell Death Dis. 20 (4), (2013).
- Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. Measuring invasion in an organotypic model. Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).
- De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth. Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).
- Fries, K. M., et al. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).
- Moutasim, K. A., et al. Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis. J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).
- Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).
- Li, J., et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells. BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).
- Szafranska, A. E., et al. Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling. J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).
