This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
تعتمد دراسة الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نضوج استهداف الجيني للسكان العصبية. ومع ذلك، فقد أثبتت مهمة تقييد التعبير عن الجينات التي تهم فرعية العصبية محددة صعبة بشكل ملحوظ بسبب الندرة النسبية للعناصر المروج محددة. interneurons GABAergic يشكل السكان الخلايا العصبية مع التنوع الجيني والمورفولوجي واسعة النطاق. في الواقع، تم التعرف على أكثر من 11 أنواع فرعية مختلفة من interneurons GABAergic في القشرة الماوس 1. هنا نقدم بروتوكول تكييفها لاستهداف انتقائي للسكان GABAergic. حققنا النوع الفرعي الاستهداف الانتقائي للinterneurons GABAergic باستخدام عنصر محسن من النسخ homeobox العوامل Dlx5 وDlx6، المتماثلات من ذبابة الفاكهة البعيدة أقل (دلل) الجينات 2،3، لدفع التعبير عن جينات محددة من خلال Electroporation للفي الرحم.
الجزء الأكبر من interneurons GABAergic القشرية تنشأ من هيكلين الجنينية عابرة اسمه الفضيلة العقدية سطي والذيلية (MGE وفريق الخبراء الاستشاري على التوالي) 4. Parvalbumin والسوماتوستاتين معربا عن interneurons تنشأ في MGE حين Calretinin (CR)، Vasointestinal الببتيد (VIP) وريلين reelin (إعادة) معربا عن interneurons تنشأ من فريق الخبراء الاستشاري. هذه الأنواع الفرعية عصبون يمكن تمييزها من تواريخ ميلاد لهم. يولدون MGE فرعية مستمدة بين يوم الجنينية 9.5 (E9.5) وe16.5 5،6. في المقابل، يولدون interneurons فريق الخبراء الاستشاري المستمدة من E12.5 من خلال e18.5 مع إنتاجها تبلغ ذروتها في E15.5 6. استهداف الجيني لهذه الفئة من السكان ولدوا في وقت متأخر، ومع ذلك، لا يزال بعيد المنال.
يتم التعبير عن الفئران القاصي-أقل (DLX) حصرا الجينات في الدماغ الأمامي البطني تطوير 3. interneurons GABAergic الخلايا العصبية الإسقاط والجسم المخطط ولكن الخلايا الهرمية لا القشرية التعبير عن Dlx1، 2،5، و 6 الجينات في مراحل النمو المبكرة 3. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات DLX في منطقة MGE وفريق الخبراء الاستشاري subventricular (SVZ) في جميع الأسلاف GABAergic. التعبير عن هذه الجينات يصبح يقتصر على تحديد الأنواع الفرعية في مراحل تالية للتفتل 7-9. أظهر الأدلة التجريبية السابق أن العنصر محسن Dlx5 / 6 يسمح للالاستهداف الانتقائي الأنساب GABAergic في نماذج الفئران المعدلة وراثيا 2. اختبرنا استخدام واحدة من هذه العناصر محسن في سياق episomal التعبير في مخ الفأر النامية. نحن الفرعية المستنسخة عنصر محسن Dlx5 / 6 جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من المروج وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) في bluescript (BS) العمود الفقري بلازميد (الشكل 1). قدمنا البلازميد عن طريق Electroporation للفي الرحم في E15.5 لاستهداف انتقائي CR-، وكبار الشخصيات والمعاودة النوع الفرعي 3،8،10. لدينا تقنية تسمح ل electroporation متفرق، مما يسهلإعادة إعمار الميزات المورفولوجية الخلايا سفعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات مرتفعة بشكل استثنائي في التعبير الجيني في الخلايا العصبية GABAergic القشرية تسمح للدراسات وظيفية. أجرينا الخسارة والربح من الدراسات الدالة باستخدام العديد من نوع البرية والجينات السلبية المسيطرة 11.
قيود تقنية
في حين أن هذا الأسلوب يسمح للخلية التحليل المستقل للعمليات الخلية، فإنه ليست مناسبة لتحليل السكان. وelectroporations هم متفرق جدا مع أقل من ألف خلايا electroporated في الدماغ. ونتيجة لذلك، هذه التقنية لا يمكن استخدامها لتقييم العواق…
The authors have nothing to disclose.
نحن ممتنون لLIHONG يين للمساعدة التقنية. NVD هو حاصل على جائزة NARSAD يونغ الباحث ومدعومة أيضا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5 MH095825-02 K99). ويدعم البحوث في المختبر Fishell من قبل المعهد الوطني للصحة، والمعهد الوطني للصحة العقلية (5 MH095147-02 R01، R01 MH071679-09 5)، المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (5 R01 NS081297-02، 1 P01 NS074972 -01A1) ومؤسسة سيمونز.
Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |