Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
Lo studio del sistema nervoso centrale (CNS) maturazione si basa su di targeting genetica delle popolazioni neuronali. Tuttavia, il compito di limitare l'espressione di geni di interesse per specifici sottotipi neuronali si è dimostrato straordinariamente difficile a causa della relativa scarsità di specifici elementi promotori. Interneuroni GABAergici costituiscono una popolazione neuronale con una vasta diversità genetica e morfologica. Infatti, più di 11 differenti sottotipi di interneuroni GABAergici sono stati caratterizzati nella corteccia mouse 1. Qui vi presentiamo un protocollo adatto per il targeting selettivo delle popolazioni GABAergici. Abbiamo raggiunto sottotipo selettivi mirati interneuroni GABAergici utilizzando l'elemento enhancer della trascrizione homeobox fattori Dlx5 e Dlx6, omologhi del distale-less (Dll) gene Drosophila 2,3, per guidare l'espressione di geni specifici mediante elettroporazione in utero.
Introduction
La maggior parte delle corticali interneuroni GABAergici provengono da due strutture embrionali transitori denominate le eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 4. Parvalbumina e somatostatina esprimere interneuroni sono originari del MGE, mentre Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) e Reelin (Re) che esprime interneuroni provengono dalla CGE. Questi sottotipi di interneuroni possono essere distinte dalle loro date di nascita. MGE sottotipi derivati sono nati tra il giorno embrionale 9.5 (E9.5) e e16.5 5,6. Al contrario, gli interneuroni CGE derivati nascono da E12.5 attraverso e18.5 con il loro picco produttivo di E15.5 6. L'orientamento genetico di questa popolazione tardi nato, tuttavia, rimane sfuggente.
Le distale-meno (Dlx) geni murini sono espressi esclusivamente in via di sviluppo proencefalo ventrale 3. Interneuroni GABAergici e neuroni striatali di proiezione, ma cellule piramidali corticali non esprimono Dlx1, 2,5, e 6 geni nelle prime fasi di sviluppo 3. Infatti, i geni Dlx sono espressi in zona MGE e CGE subventricolare (SVZ) in tutti i progenitori GABAergici. L'espressione di questi geni si restringe per selezionare sottotipi nelle fasi post-mitotici 7-9. Evidenza sperimentale precedente ha mostrato che l'elemento Dlx5 / 6 enhancer permette di targeting selettivo di lignaggi GABAergici in modelli di topi transgenici 2. Abbiamo testato l'uso di uno di questi elementi enhancer nel contesto di espressione episomiale nel cervello di topo in via di sviluppo. Abbiamo sub clonato l'elemento Dlx5 / 6 enhancer insieme ad un promotore minimo e la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) in un Bluescript (BS) backbone plasmide (Figura 1). Abbiamo introdotto il plasmide mediante elettroporazione in utero a E15.5 di mirare selettivamente Cr, VIP e Re- sottotipi 3,8,10. La nostra tecnica permette di elettroporazione sparse, che facilitala ricostruzione delle caratteristiche morfologiche delle cellule singe. Inoltre, eccezionalmente alti livelli di espressione genica in neuroni corticali GABAergici permette di studi funzionali. Abbiamo effettuato perdita e guadagno di studi di funzione utilizzando diversi wild type e geni dominanti negativi 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
LIMITI DELLA TECNICA
Mentre questa tecnica permette di cella di analisi autonoma di processi cellulari, non è adatto per l'analisi di popolazione. I electroporations sono molto scarse, con meno di un migliaio di cellule elettroporate al cervello. Di conseguenza, la tecnica non può essere utilizzata per valutare conseguenze comportamentali dovute alla manipolazione genetica degli interneuroni CGE-derivati.
Mentre electroporations effettuate ai sottotipi bers…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Lihong Yin per l'assistenza tecnica. NVD è destinatario di un NARSAD Young Investigator Award ed è anche sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5 K99 MH095825-02). La ricerca in laboratorio Fishell è sostenuto dal National Institute of Health, Istituto Nazionale di Salute Mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Istituto nazionale dei disordini neurologici e Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e la Fondazione Simons.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
Referências
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