두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
중추 신경계 (CNS) 성숙의 연구는 신경 세포 집단의 유전자 타겟팅에 의존한다. 그러나, 특정 신경 세포 아형의 관심의 유전자의 발현을 제한하는 작업으로 인해 특정 프로모터 요소의 상대적 부족에 현저 도전 입증되었다. GABA 성의의 interneurons 광범위한 유전 적, 형태 적 다양성을 가진 신경 세포의 인구를 구성한다. 실제로, GABA 성의의 interneurons의 11 개 이상의 서로 다른 하위 유형 마우스 피질 한 것을 특징으로하고있다. 여기에서 우리는 GABA 성 인구의 표적으로 선택에 대한 적응 프로토콜을 제시한다. 우리는 호 메오 박스 (homeobox) 전사의 증강 요소를 사용하여 GABA 성의의 interneurons의 하위 표적으로 선택 달성 자궁 일렉트로 특정 유전자의 발현을 통해 운전 Dlx5 및 Dlx6, 초파리 말초없는 (DLL) 유전자 2,3의 상 동체를, 요인.
Introduction
대뇌 피질의 GABA 성의의 interneurons의 대부분은 중간과 꼬리 신경절 eminences (각각 MGE 및 CGE)을 명명 된이 과도 배아 구조에서 발생 4. Parvalbumin 및 소마토스타틴 (somatostatin) 표현의 interneurons는의 interneurons는 CGE에서 발생 표현 Calretinin 반면 MGE 크롬 (Cr), Vasointestinal 펩티드 (VIP) 및 Reelin (재)에서 발생. 이 interneuron 하위 유형은 자신의 생일에 의해 구별 될 수있다. MGE 파생 된 하위 유형은 배아 일 9.5 (E9.5)와 e16.5 5,6 사이에서 태어난다. 반면, CGE 유래의 interneurons는 생산이 E15.5 6 고점으로 E18.5 통해 E12.5에서 태어난다. 늦게 태어난 인구의 유전자 타겟팅은, 그러나, 어려운 남아있다.
쥐의 말초없는 (DLX) 유전자를 독점적으로 개발 복부 전뇌 3 표현됩니다. GABA 성의 선조체의 interneurons 및 투영 아니라 피질 뉴런 피라미드 세포 Dlx1 표현할초기 발달 단계 3에서 2,5, 6 유전자. 실제로, DLX 유전자는 모든 GABA 성 전구 세포의 MGE 및 CGE 뇌실 영역 (SVZ)로 표현된다. 이들 유전자의 발현은 postmitotic 단계 7-9에서 서브 타입을 선택하도록 제한된다. 이전 실험적 증거는 Dlx5 / 6 인핸서 요소가 형질 전환 마우스 모델 2에서 GABA 성 계통의 선택 타겟팅을 허용 것으로 나타났다. 우리는 현상 마우스 뇌에서 에피 솜 발현의 문맥에서 이들 인핸서 요소 중 하나의 사용을 시험 하였다. 우리는 최소한의 발기인 및 bluescript (BS) 백본 플라스미드의 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) (그림 1)과 함께 Dlx5 / 6 증강 요소를 복제 서브. 우리는 선택적으로 CR-, VIP를 대상으로 E15.5에서 자궁 일렉트로에 의해 플라스미드를 도입 재는 3,8,10을 아류. 우리의 기술은 용이 스파 스 일렉트로, 수 있습니다그을음 세포의 형태 학적 특징의 재건입니다. 또한, 피질 GABA 성 뉴런의 유전자 발현의 예외적으로 높은 수준의 기능 연구를 허용한다. 우리는 손실과 여러 야생 유형 및 지배적 인 부정적인 유전자 11를 사용하여 기능 연구의 이득을 실시했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술의 한계
이 기술은 셀 프로세스 셀 자율적 분석이 가능하지만,이 집단 분석에 적합하지 않다. electroporations 뇌 당 electroporation하여보다 천 세포와 매우 드물다. 결과적으로, 기술은 CGE의 interneurons 유래의 유전자 조작으로 인한 행동 결과를 평가하기 위해 사용될 수 없다.
electroporations가 E13.5-E14.5 대상 MGE에서 파생 된 하위 유형에서 수행하지만, 효율이…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 기술 지원을 Lihong 음에 감사하고 있습니다. NVD는 NARSAD 젊은 연구자 상을받는 사람이며, 또한 NIH (5 K99 MH095825-02)에서 보조금에 의해 지원됩니다. Fishell 실험실에서 연구는 건강의 국립 연구소, 정신 건강 (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09)의 국립 연구소, 신경 질환 및 뇌졸중 (5 R01 NS081297-02의 국립 연구소에서 지원 한 P01 NS074972 -01A1)와 시몬스 재단.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
Referências
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