Subtype-selektive Elektroporation af Kortikal interneuroner
Summary
This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.
Abstract
Studiet af det centrale nervesystem (CNS) modning afhængig genetisk målretning af neuronale populationer. Imidlertid har til opgave at begrænse ekspressionen af gener af interesse til specifikke neuronale undertyper påfaldende udfordrende på grund af den relative knaphed af specifikke promotorelementer. GABAerge interneuroner udgør en neuronal befolkning med omfattende genetiske og morfologiske diversitet. Faktisk har mere end 11 forskellige undertyper af GABAerge interneuroner blevet karakteriseret i musen cortex 1. Her præsenterer vi en tilpasset protokol til selektiv målretning af GABAerge befolkninger. Vi opnåede subtype selektiv målretning af GABAerge interneuroner ved hjælp enhancer element homeobox transskriptionsfaktorerne Dlx5 og Dlx6, homologer af Drosophila distale mindre (dll) gen 2,3, til at drive ekspressionen af specifikke gener ved in utero elektroporation.
Introduction
Hovedparten af kortikale GABAerge interneuroner stammer fra to forbigående embryonale strukturer Opkaldt mediale og caudale ganglioniske eminences (MGE og CGE henholdsvis) 4. Parvalbumin og somatostatin udtrykke interneuroner oprindelse i MGE hvorimod Calretinin (CR), Vasointestinal peptid (VIP) og Reelin (Re), der udtrykker interneuroner stammer fra CGE. Disse Interneuron undertyper kan skelnes ved deres fødselsdatoer. MGE afledte undertyper er født mellem fosterdag 9,5 (E9.5) og E16.5 5,6. I modsætning hertil er CGE afledt interneuroner født fra E12.5 gennem e18.5 med deres produktion toppede ved E15.5 6. Den genetiske målretning af dette sene født befolkning, forbliver dog undvigende.
De murine distale mindre (Dlx) gener udelukkende udtrykkes i det udviklende ventrale forhjerne 3. GABAerge interneuroner og striatale projektion neuroner, men ikke kortikale pyramideformede celler udtrykker Dlx1, 2,5 og 6 gener på tidlige udviklingsstadier 3. Faktisk er de Dlx generne udtrykkes i MGE og CGE subventrikulære zone (SVZ) i alle GABAerge stamceller. Ekspression af disse gener bliver begrænset til at vælge undertyper på postmitotiske trin 7-9. Forrige eksperimentelle beviser viste, at Dlx5 / 6 enhancerelement giver mulighed for selektiv målretning af GABAerge slægter i transgene musemodeller 2. Vi testede anvendelsen af en af disse enhancerelementer i forbindelse med episomale ekspression i den udviklende musehjerne. Vi sub klonet Dlx5 / 6 enhancerelement sammen med en minimal promotor og den forbedrede grønt fluorescerende protein (eGFP) i en Bluescript (BS) backbone plasmid (figur 1). Vi introducerede plasmidet ved hjælp af in utero elektroporation ved E15.5 til selektivt at målrette Cr-VIP og Re- undertyper 3,8,10. Vor teknik tillader sparsomme elektroporation, hvilket lettergenopbygningen af morfologiske træk singe celler. Desuden de usædvanligt høje niveauer af genekspression i corticale GABAerge neuroner giver mulighed for funktionelle studier. Vi udførte tab og gevinst på funktions undersøgelser med anvendelse af flere vildtype og dominerende negative gener 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Begrænsninger af teknikken
Selvom denne teknik giver mulighed for celleautonom analyse af celleprocesser, er det ikke egnet til befolkningen analyse. De elektroporeringer er meget sparsomme med mindre end et tusinde celler elektroporeret pr hjernen. Som følge heraf kan teknikken ikke anvendes til at vurdere adfærdsmæssige konsekvenser af genmanipulation af CGE-afledte interneuroner.
Mens elektroporeringer udført ved E13.5-E14.5 mål MGE-afledte undertyper, e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Lihong Yin til teknisk bistand. NVD er en modtager af en NARSAD Young Investigator Award og er også støttet af tilskud fra NIH (5 K99 MH095825-02). Forskning i Fishell laboratoriet er støttet af National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of Neurologiske og Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) og Simons Foundation.
Materials
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0mm OD x 0.75mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
Referências
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
