विषाक्त साँस रासायनिक परीक्षण के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में
Summary
इस प्रोटोकॉल साँस जहरीले रसायनों को सेल संस्कृतियों का जोखिम विधि का प्रदर्शन करने के लिए बनाया गया है. विभेदित हवा तरल इंटरफेस airway उपकला कोशिकाओं की (अली) संस्कृतियों का एक्सपोजर क्लोरीन जैसे विषैली गैसों को airway निवेश का एक अनूठा मॉडल उपलब्ध कराता है. इस पांडुलिपि में हम क्लोरीन उपकला कोशिकाओं की हवा तरल इंटरफेस संस्कृतियों पर जोखिम और cardiomyocytes के जलमग्न संस्कृति के प्रभाव का वर्णन. इन विट्रो जोखिम प्रणालियों महत्वपूर्ण यंत्रवत अध्ययनों तो उपन्यास चिकित्सीय एजेंट विकसित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि रास्ते का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
सेल संस्कृतियों पूर्व पशु मॉडल में उनके उपयोग के लिए चिकित्सीय एजेंट की प्रभावकारिता को विकसित करने और अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य हैं. हम अच्छी तरह से विभेदित मानव airway उपकला और हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं मॉडल के लिए अद्वितीय क्षमता है. यह सामान्य रूप से सेल सतहों के साथ बातचीत, और पानी के साथ प्रतिक्रिया, और जलमग्न संस्कृतियों में उनके प्रभाव को सीमित करने पर विभिन्न byproducts के रूप कर सकते हैं कि क्लोरीन जैसे जहरीले साँस रसायन, के हानिकारक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण हो सकता है. एयर liqiuid इंटरफेस में अच्छी तरह से विभेदित मानव airway उपकला सेल संस्कृतियों का प्रयोग हमारे मॉडल इस सीमा में गतिरोध उत्पन्न करने के साथ ही संभावित जहरीला साँस रसायनों की विषाक्तता के महत्वपूर्ण तंत्र का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है. हम झिल्ली अखंडता का बढ़ाया हानि, ऐसे क्लोरीन जोखिम के रूप में विषाक्त साँस रासायनिक पर कस्पासे रिहाई और मृत्यु का वर्णन है. इस अनुच्छेद में, हम स्तनधारी दिल और airway उपकला सी में क्लोरीन जोखिम मॉडल करने के तरीकों का प्रस्तावसंस्कृति और इन प्रकार की कोशिकाओं पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सरल परीक्षण में एल्स.
Introduction
विषाक्त साँस रसायन (tics) के लिए जोखिम / क्लोरीन (सीएल 2) के रूप में गैसों आकस्मिक जोखिम में के रूप में अच्छी तरह से एक रासायनिक खतरा एजेंट के रूप में अपनी क्षमता के इस्तेमाल में चल रहे एक स्वास्थ्य चिंता का विषय बनी हुई है. फेफड़ों प्राथमिक लक्ष्य कर रहे हैं, जैसे हृदय और मस्तिष्क के रूप में अंगों को भी vivo मॉडल आम तौर पर tics से परीक्षण विषाक्तता के लिए उपयोग किया जाता है. 1-3 से प्रभावित हैं, लेकिन विषाक्तता मूल्यांकन के लिए इन विट्रो assays में प्रभावी लागत, सरल तेजी से और अधिक कर रहे हैं. में इन विट्रो मॉडल भी vivo में मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल हो सकता है कि एजेंट सेल बातचीत की व्यापक जांच के लिए अनुमति देते हैं. ऐसे में इन विट्रो जोखिम प्रणालियों दुर्लभ हैं और इसके अलावा, विषाक्त एजेंटों कोशिकाओं डूबे हुए हैं जिसमें संस्कृति के माध्यम से जोड़ रहे हैं, जहां कुछ पारंपरिक मॉडल में, एजेंट के गुणों के कारण बातचीत और मध्यम में घटकों के लिए बाध्य करने के लिए परिवर्तित कर सकते हैं. जैसे इस तरह के परिदृश्यों सेल संस्कृति प्रणालियों में हवा तरल इंटरफेस (अलीसीधे गैसीय एजेंटों को उजागर किया जा सकता है कि यहां प्रस्तावित प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं, के) संस्कृतियों का वादा किया जा सकता है.
Airway अस्तर उपकला कोशिकाओं साँस जहरीले रसायनों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं. मानव airway उपकला फेफड़ों में लुमेन और अंतर्निहित कोशिकाओं के बीच एक शारीरिक बाधा रूपों और फेफड़ों की प्रतिक्रिया में भाग लेता है. यह एक साइटोकिन्स और अन्य समर्थक और विरोधी भड़काऊ एजेंटों की संख्या के साथ ही उपकला कवर बलगम / airway सतह तरल (एएसएल) स्रावित करता है पैदा करता है. इन विट्रो संस्कृति सिस्टम में डूबे हुए परम्परागत में सीमाओं में से एक उपकला सतह को कवर किया है कि एएसएल और बलगम हटा या पतला है कि भी है. यह हवा के संपर्क में हैं कि फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं के शारीरिक हालत को प्रतिबिंबित नहीं करता. इस प्रकार, घरेलू विषाक्तता परीक्षण के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक आदर्श इस संरचना को दोहराने चाहिए. तेजी से जांच एम के विकास में बहुत रुचि हैविवो विषाक्तता में अनुमान है कि ethods. अली से बढ़ी उपकला कोशिकाओं को अलग और अच्छी तरह से विभेदित संरचना और कार्य जलमग्न विकसित कोशिकाओं की तुलना में और वायुमार्ग की एक बेहतर मॉडल की सेवा.
इस अध्ययन में, हम मानव airway की हवा तरल इंटरफेस संस्कृति जहरीला साँस गैस विषाक्तता परीक्षण के लिए (tracheobronchial) उपकला कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन है और इसलिए विषाक्तता का एक और महत्वपूर्ण लक्ष्य का अध्ययन, cardiomyocyte की एक जलमग्न सेल संस्कृति के साथ तुलना करें.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक फेफड़ों में एक जहरीला रसायन साँस लेता है जब तीव्र विषाक्त जोखिम का सबसे आम प्रकार से होता है. इन रसायनों भी जल्दी खून में लिया जा सकता है और इस तरह के मस्तिष्क और दिल के रूप में अन्य अंगों को प्रभावित क…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध प्रतिक्रिया कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच), निदेशक के कार्यालय, और पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान (NIEHS) अनुदान संख्या U54 ES015678 (CWW) द्वारा समर्थित है. एसए भी बच्चों के अस्पताल खान सहयोग पायलट पुरस्कार # G0100394 और बच्चों के अस्पताल के कोलोराडो अनुसंधान संस्थान पायलट पुरस्कार # G0100471 के कोलोराडो / कोलोराडो स्कूल द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referências
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