Zehirli İnhale Kimyasal Test in vitro Hücre Kültürü Modeli
Summary
Bu protokol, inhale zehirli kimyasal maddelere maruz kalma, hücre kültürlerinin bir yöntem göstermek için tasarlanmıştır. Farklı hava-sıvı arayüzü hava yolu epitel hücreleri (ALI) kültürler maruz kalmak, klor gibi zehirli gazlar hava yolu maruz eşsiz bir model sağlar. Bu yazıda; klor epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüz kültürleri üzerinde maruz kalma ve kardiyomiyositlerde daldınlarak kültür etkisini tarif eder. In vitro maruz sistemleri önemli mekanik çalışmalar, daha sonra yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi için yararlanılabilir yollarını belirlemek için izin verir.
Abstract
Hücre kültürleri önce hayvan modellerinde kullanımı için terapötik maddeler, etkinliğini geliştirmek ve çalışma için vazgeçilmezdir. Biz de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel ve kalp kası hücrelerini modellemek için benzersiz bir yeteneğe sahiptir. Bu, normal olarak hücre yüzeyleri ile etkileşim ve su ile reaksiyona sokulması, ve daldırılmış kültürde etkilerini sınırlayarak üzerine çeşitli yan ürünler oluşturabilir, örneğin klor gibi toksik kimyasallar inhale, zararlı etkilerini incelemek için değerli bir araç olabilir. Hava-liqiuid arayüzü de farklılaştırılmış insan solunum yolu epitel hücre kültürleri kullanarak Bizim modelimiz bu sınırlama circumvents yanı sıra potansiyel zehirli solunan kimyasalların toksisite kritik mekanizmalarını değerlendirmek için bir fırsat sağlar. Biz membran bütünlüğünün kaybı gelişmiş, örneğin klor maruz kalma gibi toksik solunan kimyasal, kaspaz salınımı ve ölümü tarif. Bu yazıda, memeli kalp ve solunum yolu epitel c klor pozlama modellemek için yöntemler önermekkültür ve bu hücre tipleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için basit testler arşın.
Introduction
Toksik inhale kimyasal (TIC) maruz / klorin (Cl 2) gibi gazlar kazara maruz kalma, hem de kimyasal bir tehdit madde olarak potansiyel kullanımı devam eden bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Akciğerler birincil hedef olmasına rağmen, bu tür, kalp ve beyin gibi organlar da in vivo modeller genellikle tikler ikinci test toksisite için kullanılır. 1-3 etkilenmez, ancak toksisite değerlendirmesi için in vitro deneylerde maliyet etkin, daha basit, daha hızlı ve daha vardır. In in vitro modeller de in vivo değerlendirmek için zor olabilir aracı-hücre etkileşimlerinin kapsamlı araştırma için izin verir. Bu tür in vitro maruz sistemleri nadirdir ve bundan başka, toksik maddeler, hücrelerin batık edildiği kültür ortamına ilave bazı geleneksel modeller ile, maddelerin özellikleri nedeniyle etkileşimleri ve ortam içinde bileşenlerine bağlanma değiştirebilir. Gibi bu tür senaryolar hücre kültür sistemlerinde hava-sıvı arayüzü (ALI, Gazlı maddeler maruz olabilir burada önerilen birincil insan solunum yolu epitel hücreleri, of) kültürleri umut verici olabilir.
Hava yolunu döşeyen epitel hücreleri solunan toksik kimyasallara karşı ilk savunma hatları. Insan solunum yolu epitel akciğerde lümen ve temel hücreler arasında, fiziksel bir bariyer oluşturur ve akciğerin yanıt olarak katılır. Bu sitokinler ve diğer pro-ve anti-enflamatuar maddelerin sayısı hem de epitel mukus kaplama / hava yolu yüzey sıvısı (ASL) salgılar üretir. In vitro kültür sistemleri batık geleneksel olarak sınırlamalar biri epitel yüzeyini kaplayan ASL ve mukus kaldırıldı veya seyreltilmiş olması aynı zamanda. Bu havaya maruz kalan akciğer epitel hücrelerin fizyolojik durumunu yansıtmaz. Böylece, EFT toksisite testleri için vitro sistemde ideal Bu mimariye çoğaltmak gerekir. Hızlı tarama m yönelik büyük ilgi varvivo toksisitesi tahmin ethods. ALI yetiştirilen epitel hücreleri ayırt var ve iyi farklılaşmış yapıları ve işlevleri batık yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında ve hava yollarının üstün bir model işlevi.
Bu çalışmada, insan solunum yolu hava-sıvı arayüzü kültür zehirli Solunum toksisite için test (trakeo) epitel hücreleri kullanılmasını tarif eder ve bu nedenle toksiklik önemli bir hedef eğitim, kardiyomiyosit bir batık hücre kültürü ile karşılaştırın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir ciğerlerine zehirli bir kimyasal nefes zaman akut toksik risklerin en yaygın türü oluşur. Bu kimyasallar da hızlı bir şekilde kan alınmış olabilir ve bu, beyin ve kalp gibi diğer organları etkileyebilir. Hayvan modelleri kullanarak çeşitli maddelerin solunması toksisitesi okudu ve yaygın bildirilen, ancak mekanizmaları daha az anlaşılmıştır. Bu etkili tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir engeldir. In vitro maruziyet sistemlerinin bulunmaması mekanistik anlayış eksikliği arka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma karşı Programı, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Müdürü Ofisi ve Çevre Sağlığı Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIEHS) Hibe sayısı U54 ES015678 (CWW) tarafından desteklenmektedir. SA da Çocuk hastanesinde Mines İşbirliği Pilot Ödülü # G0100394 ve Çocuk Hastanesi Colorado Araştırma Enstitüsü Pilot Ödülü # G0100471 Colorado / Colorado School tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referências
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
