对于中吸入有毒化学测试体外细胞培养模型
Summary
此协议的目的是证明细胞培养物对吸入有毒化学品的曝光方法。曝光的区别空气 – 液体界面的气道上皮细胞（ALI）的培养物提供了呼吸道暴露于有毒气体，如氯气的独特模式。在这个手稿，我们描述对上皮细胞的气-液界面培养氯曝光和心肌细胞的液体培养的效果。 体外曝光系统允许重要机理研究，以评估，然 后可以用于开发新的治疗剂的途径。
Abstract
细胞培养是必不可少的开发和研究治疗药物，其在动物模型中使用前药效。我们的模型以及分化的人类气道上皮细胞和心脏肌肉细胞的独特能力。这可能是非常有用的工具来研究的毒性吸入的化学物质，如氯，可以通常与细胞表面相互作用，并且在与水反应，并限制了它们在液态培养的影响形成的各种副产物的有害影响。采用高分化人支气管上皮细胞培养在空中liqiuid接口我们的模型绕过这个限制，以及提供了一个机会，以评估潜在的有毒化学物质吸入毒性的关键机制。我们描述了增强的损失细胞膜的完整性，一旦吸入有毒化学蛋白酶的释放和死亡，如氯曝光。在这篇文章中，我们提出的方法氯气暴露在哺乳动物心脏和呼吸道上皮C型号英语学习者的文化和简单的测试，以评估其对这些细胞类型的影响。
Introduction
接触有毒化学物质吸入（国际信托）/气体如氯（Cl 2）保持在意外风险，以及在其作为化学威胁代理可能使用一个持续的健康问题。虽然肺是主要的目标，器官，如心脏和大脑也受到影响1-3。 体内模型通常用于从国际信托测试毒性，但在体外实验进行毒性评估更简单，更快速，更具成本效益。 在体外模型还允许对可能难以在体内评估代理-细胞相互作用广泛的调查。这种体外曝光系统是罕见的，而且，在有毒物质被添加到其中的细胞被淹没培养基某些常规型号，代理商的属性可以改变由于相互作用和结合的培养基成分。在这样的情况下的细胞培养系统，例如气 – 液界面（ALI人原代气道上皮细胞，在这里提出，可直接暴露于气态试剂的）培养物可能是有希望的。
上皮细胞衬里的气道是抵御吸入有毒化学品的第一线。人类气道上皮细胞形成在肺中的腔管和相关的细胞之间的物理屏障，并参与肺的响应。它产生的许多细胞因子和其他亲和抗炎剂，以及分泌粘液/气道表面液体（ASL）覆盖的上皮。一个在常规浸没在体外培养系统中的限制也是覆盖上皮表面ASL和粘液除去或稀释。这并不反映被暴露在空气中的肺上皮细胞的生理条件。因此， 在体外系统的理想旅游业议会毒性试验应重复这种架构。目前在开发快速筛选米的极大兴趣ethods的预测体内毒性。在ALI生长上皮细胞分化并具有分化良好的结构和功能相比，细胞生长淹没和服务于呼吸道的卓越典范。
在这项研究中，我们描述了使用人的气道（支气管）上皮细胞，用于测试有毒气体吸入毒性气 – 液界面培养物，并将其与心肌细胞的浸没式细胞培养进行比较，从而研究毒性的另一个重要目标。
Protocol
Representative Results
Discussion
当一个人呼吸有毒化学进入肺部急性毒性暴露的最常见的类型出现。这些化学物质也可以迅速吸收到血液中，并可能影响其他器官，如大脑和心脏。利用动物模型各种药剂吸入毒性进行了研究和广泛报道，但是机制了解较少。这是开发有效的治疗的一个主要障碍。 体外照射系统的缺席的背后是缺乏机械的见解的一个主要原因。在这里，我们描述了心脏肌肉和呼吸道，研究吸入有毒的化学物…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由抵消计划，美国国立卫生研究院（NIH），办公室主任，以及环境卫生科学研究所（NIEHS）授权号码U54 ES015678（CWW）的支持。 SA也由儿童医院的矿业合作试点奖＃G0100394和儿童医院科罗拉多研究所研究试点奖＃G0100471的科罗拉多州/科罗拉多学院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
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