في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة
Summary
تم تصميم هذا البروتوكول لإظهار طريقة التعرض للثقافات الخلية لاستنشاق المواد الكيميائية السامة. تعرض متباينة واجهة الهواء السائل (علي) الثقافات من الخلايا الظهارية الهوائية يوفر نموذجا فريدا للتعرض الشعب الهوائية للغازات السامة مثل الكلور. في هذا المخطوط وصفنا تأثير استنشاق الكلور على الثقافات واجهة الهواء السائل من الخلايا الظهارية والثقافة المغمور من العضلية. في المختبر أنظمة التعرض تسمح الآلية الدراسات الهامة لتقييم المسارات التي يمكن عندئذ أن تستخدم لتطوير العوامل العلاجية الرواية.
Abstract
مزارع الخلايا لا غنى عنها لتطوير ودراسة فعالية العوامل العلاجية، وذلك قبل استخدامها في النماذج الحيوانية. لدينا قدرة فريدة لنموذج خلايا ظهارة الهوائية الإنسان وعضلة القلب متباينة بشكل جيد. هذا يمكن أن يكون أداة لا تقدر بثمن لدراسة الآثار الضارة للمواد الكيميائية السامة المستنشقة، مثل الكلور، التي يمكن أن تتفاعل عادة مع أسطح الخلايا، وشكل مختلف منتجاته على التفاعل مع المياه، والحد من آثارها في الثقافات المغمورة. لدينا نموذج باستخدام متباينة بشكل جيد الثقافات الخلايا الظهارية البشرية الهوائية في واجهة الهواء liqiuid تلتف هذا القيد وكذلك توفر فرصة لتقييم آليات حاسمة من سمية المواد الكيميائية السامة المستنشقة المحتملة. نحن تصف خسارة تعزيز النزاهة الغشاء، وإطلاق سراح كاسباس والموت على استنشاق مادة كيميائية سامة مثل التعرض الكلور. في هذه المقالة، فإننا نقترح أساليب لنمذجة التعرض الكلور في قلب الثدييات والهوائية الظهارية جأذرع في الثقافة واختبارات بسيطة لتقييم تأثيرها على أنواع الخلايا هذه.
Introduction
التعرض للمواد الكيميائية السامة المستنشقة (التشنجات اللاإرادية) / غازات مثل الكلور (الكلورين 2) لا يزال مصدر قلق الصحية الجارية في التعرض العرضي وكذلك في استخدام إمكاناتها كعامل تهديد الكيميائية. على الرغم من أن الرئتين هي الهدف الأساسي، وأجهزة مثل القلب والدماغ التي تتأثر أيضا 1-3. تستخدم في الجسم الحي عموما نماذج لاختبار سمية من التشنجات اللاإرادية، ولكن في فحوصات المختبر لتقييم سمية هي أبسط وأسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة. و تسمح المختبر النماذج أيضا للتحقيق واسعة من التفاعلات خلية العامل الذي قد يكون من الصعب تقييم في الجسم الحي. مثل هذه النظم في المختبر التعرض نادرة وعلاوة على ذلك، في بعض النماذج التقليدية حيث يتم إضافة المواد السامة إلى مستنبت في الخلايا التي يتم المغمورة، خصائص وكلاء يمكن أن تتغير بسبب التفاعلات وملزمة للمكونات في المتوسط. في سيناريوهات مثل هذه الأنظمة ثقافة الخلية مثل واجهة الهواء السائل (ALI) الثقافات من الخلايا الأولية الظهارية البشرية الهوائية، المقترح هنا، التي يمكن أن يتعرض مباشرة إلى وكلاء الغازية يمكن أن تكون واعدة.
الخلايا الظهارية المبطنة لمجرى الهواء هي خطوط الدفاع الأول ضد استنشاق المواد الكيميائية السامة. ظهارة الهوائية الإنسان يشكل حاجز مادي بين التجويف والخلايا الكامنة في الرئة ويشارك في استجابة الرئة. وتنتج عددا من السيتوكينات وغيرها من العوامل المؤيدة والمضادة للالتهابات، وكذلك تفرز المخاط السائل سطح / الهوائية (ASL) تغطي الظهارة. واحدة من القيود التقليدية في أنظمة غارقة في الثقافة المختبر هو أيضا أن ASL والمخاط التي تغطي سطح الظهارية تتم إزالة أو المخفف. هذا لا يعكس حالة فسيولوجية من الرئة الخلايا الظهارية التي تتعرض للهواء. وبالتالي، ينبغي مثالية في نظام المختبر لاختبار السمية TIC تكرار هذه العمارة. هناك مصلحة كبيرة في تطوير الفحص السريع مethods التي تتنبأ سمية الجسم الحي. الخلايا الظهارية نمت في ALI تمييز ولها هياكل ووظائف متباينة جيدا مقارنة مع الخلايا المزروعة المغمورة ويخدم نموذجا متفوقة في الشعب الهوائية.
في هذه الدراسة، ونحن تصف استخدام الثقافة الهواء السائل واجهة من مجرى الهواء الإنسان (الرغامية القصبية) الخلايا الظهارية لاختبار سمية الغاز السامة المستنشقة ومقارنتها مع ثقافة الخلية المغمور من cardiomyocyte، وبالتالي دراسة هدف هام آخر من السمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
النوع الاكثر شيوعا من التعرض السامة الحادة يحدث عند واحد يتنفس مادة كيميائية سامة إلى الرئتين. ويمكن أيضا أن تؤخذ هذه المواد الكيميائية بسرعة في مجرى الدم ويمكن أن تؤثر الأجهزة الأخرى مثل الدماغ والقلب. يتم دراسة سمية استنشاق كلاء المختلفة باستخدام نماذج حيوانية وع?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البحث من قبل برنامج مكافحة والمعاهد الوطنية للصحة (NIH)، مكتب المدير، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية (معهد علوم الصحة البيئية) غرانت عدد U54 ES015678 (CWW). ويدعم أيضا SA مستشفى الأطفال مدرسة كولورادو / كولورادو للمناجم التعاون جائزة الطيار # G0100394 ومستشفى الأطفال في جائزة البحوث التجريبية كولورادو المعهد # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referências
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
