In vitro delle cellule Cultura modello per Tossico per inalazione Chemical Testing
Summary
Questo protocollo è progettato per dimostrare metodo di esposizione di colture cellulari a sostanze chimiche tossiche inalate. Esposizione di differenziata interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule epiteliali delle vie aeree fornisce un modello unico di esposizione vie aeree per gas tossici quali cloro. In questo manoscritto descriviamo effetto dell'esposizione cloro su colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali e coltura sommersa di cardiomiociti. Sistemi di esposizione in vitro consentono importanti studi meccanicistici per valutare percorsi che possono poi essere utilizzati per sviluppare nuovi agenti terapeutici.
Abstract
Le colture cellulari sono indispensabili per sviluppare e studiare l'efficacia di agenti terapeutici, prima del loro utilizzo in modelli animali. Abbiamo la capacità unica di modellare cellule dell'epitelio delle vie respiratorie umane e del muscolo cardiaco ben differenziate. Questo potrebbe essere uno strumento prezioso per studiare gli effetti deleteri delle sostanze chimiche tossiche per via inalatoria, come il cloro, che può normalmente interagire con le superfici delle cellule e formare vari sottoprodotti su reagendo con l'acqua, e limitare i loro effetti nelle culture sommerse. Il nostro modello utilizzando colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane ben differenziati a interfaccia aria-liqiuid aggira questa limitazione, nonché offre la possibilità di valutare i meccanismi critici di tossicità delle sostanze chimiche potenzialmente tossiche per via inalatoria. Descriviamo una maggiore perdita dell'integrità della membrana, il rilascio caspasi e morte su tossica chimica per via inalatoria come l'esposizione al cloro. In questo articolo, vi proponiamo i metodi per modellare l'esposizione cloro nel cuore dei mammiferi e delle vie respiratorie epiteliale cells di cultura e di semplici test per valutare il suo effetto su questi tipi di cellule.
Introduction
Esposizione a sostanze chimiche tossiche inalatoria (tic) / gas come cloro (Cl 2) rimane un problema sanitario in corso in esposizioni accidentali che nel loro uso potenziale come agente minaccia chimica. Anche se i polmoni sono l'obiettivo primario, organi come cuore e cervello sono anche colpiti 1-3. Modelli in vivo sono generalmente utilizzati per la tossicità di test da tic, ma in vitro per la valutazione della tossicità sono più semplici, più veloci e più conveniente. In modelli in vitro consentono anche vasto studio delle interazioni agente-cellulari che possono essere difficili da valutare in vivo. Tali sistemi di esposizione in vitro sono rari e inoltre, in alcuni modelli convenzionali dove gli agenti tossici vengono aggiunti al mezzo di coltura in cui le cellule sono sommersi, le proprietà degli agenti possono cambiare a causa di interazioni di legame e dai componenti del mezzo. In tali scenari sistemi di coltura cellulari come interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule primarie umane epiteliali delle vie aeree, qui proposte, che possono essere direttamente esposti ad agenti gassosi potrebbero essere promettenti.
Cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie sono le prime linee di difesa contro le sostanze chimiche tossiche inalate. L'epitelio delle vie aeree umano forma una barriera fisica tra il lume e le celle sottostanti nel polmone e partecipa alla risposta del polmone. Si produce una serie di citochine e altri agenti pro e anti-infiammatori e secerne muco liquido superficie / vie aeree (ASL) che copre l'epitelio. Una delle limitazioni nella convenzionale sommerso de sistemi di coltura in vitro è anche che l'ASL e muco che copre la superficie epiteliale viene rimosso o diluite. Questo non riflette lo stato fisiologico delle cellule epiteliali del polmone che sono esposte all'aria. Così, un sistema ideale in vitro per test di tossicità TIC dovrebbe replicare questa architettura. C'è grande interesse per lo sviluppo rapido di screening metodi che predicono tossicità vivo. Le cellule epiteliali coltivate nella ALI differenziare e hanno strutture e funzioni ben differenziati rispetto alle cellule coltivate sommerse e servire un modello superiore delle vie respiratorie.
In questo studio, descriviamo l'uso della cultura aria-liquido-interfaccia vie respiratorie umane (tracheobronchiale), le cellule epiteliali per testare la tossicità velenoso gas inalato e lo confrontiamo con una cultura di cellule sommerso di cardiomiociti, quindi studiando un altro obiettivo importante di tossicità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il tipo più comune di esposizioni tossiche acuta si verifica quando si respira una sostanza chimica velenosa nei polmoni. Queste sostanze chimiche possono anche essere rapidamente assorbiti nel flusso sanguigno e possono influenzare altri organi come il cervello e il cuore. Tossicità per inalazione di vari agenti utilizzando modelli animali è stata studiata e riportata ampiamente, ma i meccanismi sono meno conosciuti. Questo è un grande ostacolo nello sviluppo di terapie efficaci. Assenza di sistemi di esposizione <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è sostenuta dal Programma CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Ufficio del Direttore, e l'Istituto Nazionale delle Scienze di Salute ambientale (NIEHS) Sovvenzione Numero U54 ES015678 (CWW). SA è supportato anche da ospedale per bambini Colorado / Colorado School of Mines collaborazione Pilot Award # G0100394 e Ospedale Pediatrico Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referências
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
