有毒吸入化学試験のためのin vitroでの細胞培養モデルにおける
Summary
このプロトコルは、有毒な化学物質を吸入するための細胞培養物の露光方法を実証するために設計されている。差別化され気液界面の気道上皮細胞の（ALI）の文化の暴露は、塩素などの有毒ガスに対する気道曝露のユニークなモデルを提供します。本稿では、上皮細胞および心筋細胞の液体培養の気液界面培養物における塩素曝露の影響を記載している。 インビトロ露光システムは、重要な機構的研究は、次いで、新規な治療薬を開発するために利用することができる経路を評価することを可能にする。
Abstract
細胞培養物は、従来の動物モデルにおけるそれらの使用、治療薬の効力を開発し研究することが不可欠である。我々は、よく分化したヒト気道上皮および心筋細胞をモデル化する独特の能力を有する。これは、通常、細胞表面と相互作用し、水と反応し、水没の文化でその効果を制限する際に、様々な副生成物を形成することができる塩素などの有毒化学物質の吸入、の有害な影響を研究するための貴重なツールである可能性があります。エアliqiuid界面における高分化ヒト気道上皮細胞培養物を使用して我々のモデルは、この制限を回避するだけでなく、潜在的な有毒化学物質の吸入毒性の重要なメカニズムを評価する機会を提供します。私たちは、このような塩素暴露などの有毒化学物質の吸入の際に強化された膜の完全性の損失、カスパーゼリリースと死について説明します。この記事では、哺乳動物の心臓や気道上皮Cの塩素暴露をモデル化する方法が提案されている文化とこれらの細胞型への影響を評価するための簡単なテストでのエル。
Introduction
塩素などの有毒化学物質の吸入（TICを）/ガス（CL 2）への曝露は、偶発的暴露中だけでなく、化学的脅威エージェントとしての使用の可能性の継続的な健康問題のまま。肺が主なターゲットであるが、このような心臓や脳などの臓器はまた、in vivoモデルは、一般のTICからテストの毒性のために使用されています。1-3に影響を与えたが、毒性評価のためのin vitroアッセイで効果的なコスト、単純で、より速く、より公開されています。 でvitroモデルは、in vivoで評価することが困難な場合があるエージェント-細胞相互作用の広範な調査を可能にします。このようなインビトロ露光システムはまれであり、また、毒性因子は、細胞を浸漬した培養培地に添加されるいくつかの従来のモデルでは、薬剤の特性は、相互作用は、培地中の成分への結合を変更することができる。例えば、このようなシナリオの細胞培養系における気液界面（ALI）を直接ガス状物質にさらされる可能性がここで提案初代ヒト気道上皮細胞の培養物は有望であり得る。
気道の内側を覆う上皮細胞は、吸入毒性化学物質に対する防御の最初の行です。ヒト気道上皮は、肺内腔と基礎となる細胞との間の物理的な障壁を形成し、肺の応答に参加しています。これは、サイトカインおよび他のプロと抗炎症剤の数を生成だけでなく、粘液/上皮をカバーする、気道表面液（ASL）を分泌する。 インビトロ培養系に沈め従来における制限の1つは、上皮表面を覆うASL粘液を除去または希釈されることもある。これは、空気にさらされている肺上皮細胞の生理状態を反映していない。このように、TIC毒性試験のためのin vitro系における理想は、このアーキテクチャを複製する必要があります。迅速なスクリーニングmを開発することに大きな関心が寄せられている生体毒性を予測するethods。 ALIで増殖させた上皮細胞が水没し、気道の優れたモデルを提供し増殖した細胞と比較して、高分化型の構造と機能を差別化している。
本研究では、有毒吸入ガスの毒性をテストするためのヒト気道（気管支）上皮細胞の気液界面の文化の使用を記載し、したがって毒性のもう一つの重要な目標を検討し、心筋細胞の水没細胞培養と比較します。
Protocol
Representative Results
Discussion
1が肺に有毒化学物質を呼吸する際に、急性毒性曝露の最も一般的なタイプが発生します。これらの化学物質はまた、迅速に血流中に取り込まれてもよく、例えば、脳や心臓などの他の臓器に影響を与えることができる。動物モデルを用いて種々の薬剤の吸入毒性が研究され、広く報告されている、しかし、メカニズムはあまりよく理解されている。これは効果的な治療法の開発に大きなハ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CounterACTは、プログラム、国立衛生研究所（NIH）、ディレクターのOffice、および環境健康科学研究所（NIEHS）助成金番号U54 ES015678（CWW）でサポートされています。 SAはまた、小児病院コロラド州/コロラドスクールオブマインズコラボレーションパイロット賞＃G0100394および小児病院コロラド州リサーチインスティチュートパイロット賞＃のG0100471によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
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