In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhalert Chemical Testing
Summary
Denne protokollen er utformet for å demonstrere fremgangsmåten eksponering av cellekulturer til inhalerte giftige kjemikalier. Eksponering av differensiert luft-væske-grensesnittet (ALI) kulturer av luftveis epitelceller gir en unik modell av luftveis eksponering for giftige gasser som klor. I dette manuskriptet beskriver vi effekten av klor eksponering på luft-væske-grensesnittet kulturer av epitelceller og neddykket kultur kardiomyocytter. In vitro eksponering systemer tillater viktige mekanistiske studier for å evaluere trasé som dermed kan brukes til å utvikle nye terapeutiske midler.
Abstract
Cellekulturer er uunnværlig for å utvikle og å studere effekten av terapeutiske midler, før deres bruk i dyremodeller. Vi har en unik evne til å modellere godt differensiert menneskelige luftveier epitel og hjertemuskelceller. Dette kan være et uvurderlig verktøy for å studere de skadelige virkninger av giftige inhalerte kjemikalier, slik som klor, som normalt kan samhandle med celleoverflatene og danner en rekke biprodukter ved reaksjon med vann, og som begrenser deres virkninger i neddykkede kulturer. Vår modell med godt differensiert menneskelige airway epithelial cellekulturer på luft-liqiuid grensesnitt omgår denne begrensningen, samt gir en mulighet til å vurdere kritiske mekanismer for toksisitet av potensielle giftige inhalerte kjemikalier. Vi beskriver forbedret tap av membranintegritet, caspase frigjøring og død ved inhalert toksisk kjemikalie slik som klor-eksponering. I denne artikkelen foreslår metoder for å modellere klor eksponering i pattedyr hjerte og luftveier epitel calen i kultur og enkle tester for å evaluere effekten på disse celletypene.
Introduction
Eksponering for giftige kjemikalier inhalerte (tics) / gasser som klor (Cl 2) gjenstår en kontinuerlig helseproblem i utilsiktet eksponering så vel som i deres potensielle anvendelse som et kjemisk middel trussel. Selv om lungene er det primære målet, er organer som hjerte og hjerne også påvirket 1-3. In vivo modeller er vanligvis brukt til testing toksisitet fra tics, men in vitro analyser for toksisitet vurdering er enklere, raskere og mer kostnadseffektivt. I vitro modeller også gi rom for omfattende etterforskning av middel-celle interaksjoner som kan være vanskelig å vurdere in vivo. Slike in vitro eksponering systemer er sjeldne, og dessuten i noen konvensjonelle modeller hvor giftstoffer tilsettes til kulturmediet hvori cellene er neddykket, kan egenskapene til de midler endres på grunn av interaksjoner og binding til komponentene i mediet. I slike scenarier cellekultursystemer som luft-væske-grensesnittet (ALI) kulturer av primære menneskelige luftveis epitelceller, som foreslås her, som kan være direkte utsatt for gass agenter kan være lovende.
Epitelceller luftveiene er de første linjene av forsvaret mot inhalert giftige kjemikalier. Den menneskelige airway epithelium danner en fysisk barriere mellom hulrommet og de underliggende celler i lungen og deltar i responsen av lungen. Den produserer en rekke cytokiner og andre pro-og anti-inflammatoriske midler, så vel som utskiller slim / luftveisoverflate væske (ASL) som dekker epitel. En av begrensningene i konvensjonell neddykket in vitro kultursystemer er også at ASL og slim som dekker den epiteliale overflate er fjernet eller fortynnet. Dette gjenspeiler ikke den fysiologiske tilstand av lunge epitelceller som er utsatt for luft. Dermed bør en ideell in vitro system for TIC toksisitetstesting gjenskape denne arkitekturen. Det er stor interesse for å utvikle rask screening methods som forut in vivo toksisitet. Epitel-celler dyrket ved ALI differensiere og har godt differensierte strukturer og funksjoner, sammenlignet med celler dyrket under vann og utføre en overlegen modell av luftrom.
I denne studien, beskriver vi bruk av luft-væske-grensesnittet kultur for menneskelig luftveier (tracheobronchial) epitelceller for testing giftig inhalert gass giftighet og sammenligne det med en neddykket cellekultur av cardiomyocyte, derav studere et annet viktig mål for toksisitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den vanligste typen akutt giftige eksponeringer oppstår når man puster en giftig kjemisk ned i lungene. Disse kjemikaliene kan også bli raskt tatt opp i blodet og kan påvirke andre organer som hjerne og hjerte. Inhalering toksisitet av forskjellige stoffer ved hjelp av dyremodeller er studert og rapportert vidt, men mekanismene er mindre godt forstått. Dette er et stort hinder i utviklingen av effektive behandlingsformer. Fravær av in vitro eksponering systemer er en primær årsak bak mangelen på mekani…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen er støttet av motvirke Program, National Institutes of Health (NIH), kontor direktør, og National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Antall U54 ES015678 (CWW). SA er også støttet av sykehus Barnas Colorado / Colorado School of Mines Samarbeid Pilot Award # G0100394 og Barnas Hospital Colorado Forskning Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
Referências
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B. Chlorine: state of the art. Lung. 183, 151-167 (2005).
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
