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Summary
미세 절제가 광범위하게 조직 내에서 DNA, RNA, 단백질의 시험을 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 새로운 밀링 기술 mesodissection는 최근 유효하다. 우리는 mesodissected 포르말린 고정 파라핀 결핵균 육아종의 내장 조직 슬라이드에서 RNA 추출을 보여줍니다.
Abstract
미세 절제는 십년에 대한 DNA, RNA 및 단백질 수준에서의 조직 검사를 위해 사용되어왔다. 레이저 캡처 현미경 (LCM)는 오늘 사용되는 가장 일반적인 미세 절제 기법입니다. 이 기술에서, 레이저 focally 탈수 조직 섹션 1 위에 놓 열가소성 막을 용해하는 데 사용됩니다. 조직 절편 복합체이어서 들리고 막으로부터 분리된다. 이 기법은 조직 검사를 위해 성공적으로 사용될 수 있지만, 시간 소모적이고 비싸다. 또한,이 기술을 이용하여 절차의 성공적인 완료 따라서 그 사용을 제한하는, 레이저의 사용을 필요로한다. mesodissection라는 새 더 저렴하고 실용적인 미세 절제 방식은 LCM의 함정에 가능한 솔루션입니다. 이 기술은 밀에 장착 된 슬라이드 조직 샘플에서 원하는 조직을 MESO-1/MeSectr 시스템을 채택에 동시에 원하는 조직 샘플을 복구하는 유체 분배 및 흡인하면서소모품 밀 비트. 해부 과정을 시작하기 전에, 사용자는 (FFPE) 포함 된 포르말린 고정 파라핀 (H & E) 기준 슬라이드 스테인드 헤 마톡 실린 및 에오신으로 밀어 맞 춥니 다. 그 후, 오퍼레이터는 소망 해부 영역에 주석 및 해당 세그먼트를 해부로 진행한다. 이 프로그램은 절개의 아카이브 이미지를 생성합니다. mesodissection의 가장 큰 장점은이 실험에서 세대를 샘플링하기 위해 설정 10 분 거리의 평균을 복용, 슬라이드를 해부하는 데 필요한 짧은 기간입니다. 또한,이 시스템은 훨씬 더 효과적인 비용과 사용자 친화적이다. 약간의 단점은 레이저 캡처 현미경처럼 정확하지 않습니다 것입니다. 이 문서에서 우리는 mesodissection은 결핵균 (Mtb의)에 의해 발생 FFPE의 육아종에서 슬라이드에서 RNA를 추출하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
샘플은 전통적으로 수동으로 전체 조직이나 바늘과 메스를 사용하여 슬라이드 하나에서 microdissected되었습니다. 이것은 그 조직의 부와 주변 조직의 2 항 사이의 명확한 분리를 필요로한다. 분자 프로파일 기술에서 현재 발전으로, 세포 수준에서 조직을 평가할 필요성이 증가되고있다. 때문에 수동 미세 절제의 제한, LCM 등의 기술이 큰 절연 정밀도 수 있도록하기 위하여 설립되었다. 이 기술은 다음과 같은 연구가 유전자 발현 프로파일 링과 같은 하류 분석법에 사용할 수있는 다양한 세포 및 슬라이드 타입으로부터 특정 세포 집단을 분리 할 수있다. 다운 스트림 분석에 매우 효과적이지만, LCM은 제한이없는 것은 아니다. 첫째, LCM은 비용과 시간이 소요되는 과정입니다. 또한, 때문에 RNA의 불안정한 특성으로 종종 LCM 샘플 2에서 고품질의 RNA를 얻기 위해 도전하고있다. 때문에 디에LCM의 sadvantages은, 미세 절제 기술의 새로운 발전은 여전히 저렴하고 시간에 민감한 방법으로 연구자의 큰 숫자에 더 접근 할 수 있도록하기 위해 필요합니다.
사용할 미세 절제 기술의 하나의 발전은 mesodissection로 알려진 기술이다. 이 기술에서 기계 공장 관심 주석 조직 섹션을 사용하고 소모품 밀 비트 3에를 흡입한다. 다음에,이 샘플 포집 관으로 흡인하고 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 시스템의 장점은 훨씬 적은 비용과 시간이 중요한 것이있다. 우리의 경험에서, 시스템 10 분의 폐 육아종 조직 부분의 절개를 할 수 있습니다. 한편, 기존의 LCM 가능성 프로세스를 완료하기 위해 시간을 필요로한다. 시스템은 오퍼레이터에 대한 주석의 비교뿐만 아니라 도구로 사용하는 기준 슬라이드를로드 할 수있다. 또한 보고서는 개요 일을 생성해부 된 슬라이드의 전자 영역입니다. mesodissection하는 두 가지 주요 단점이 있습니다. 복수의 셀을 추출하는데 효과적이지만, 그것은 하나의 세포를 분리하기 위해 도전. 또, 생성 된 화상의 정밀도는 다른 촬상 현미경을 사용하는 경우만큼 명확하지 않다.
결핵 (TB)는 주요 전염병 전세계 인류의 킬러와 Mtb의 감염의 결과입니다. 결핵균 에어로졸에 노출 된 개인의 대부분에서, 감염은 잠재적으로 제한됩니다. 매년 적어도 천만명에서, 활동성 결핵 4가 발생합니다. 잠복 감염시, Mtb의는 육아종로 알려진 병적 인 폐 병변 내에 포함되어 있습니다. 따라서 그것의 mtb 감염의 결과를 육아종 5 수준에서 결정되고 있다고 주장하고있다.
여기에서 우리는 mesodissection는 Mtb의에 의한 육아종을 microdissect하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 사용 된 슬라이드감염된 붉은 털 원숭이에서 FFPE의 폐 조직에서이다. 이 데모의 목적을 위해, 우리는 그 전체 육아종 해부 것이다. 또한 RNA가 회복 조직으로부터 추출 될 수 있다는 것을 보여준다. 이 기술은 다양한 다른 표본으로부터 조직 샘플에인가하고 하류 분석법 다양한 위해 사용될 수있다.
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Protocol
사단 이미징 소프트웨어를 사용하여 1. 보정 Mesodissection 악기
사단 이미징 소프트웨어는이 문서의 나머지 부분에 대한 소프트웨어 또는 프로그램 중 하나라고한다. 이 단계는 정확하게 화상을 추적 할뿐만 아니라, 다수의 슬라이드 프레임을 정렬하는 데 필요하다.
- 악기와 컴퓨터를 켭니다.
- 오픈 소프트웨어 및 "보정기구"를 선택합니다.
- 조이스틱을 사용하여 스테이지 이동을 보정합니다. 왼쪽 상단 위치로 무대를 이동합니다. 프로그램의 1 단계를 눌러 "설정".
- 올바른 위치를 낮은 단계로 이동합니다. 프로그램의 2 단계를 눌러 "설정".
- 먼저 헤드 어셈블리를 높이기 위해 "Z 버튼"을 눌러 포부를 보정합니다. 조이스틱을 눌러 "대기음 펄스"버튼과 "해부"버튼을 플런저 제어봉까지 최고 위치에 도달. 프로그램의 3 단계에서 "SET"키를 누르면,.
- 을 눌러 "대기음 리셋과# 8221; 버튼을 누릅니다. 플런저는 4 단계에서 아래의 위치를 눌러 "설정"에서 정지되면.
- "규모 탭"을 클릭합니다.
- 빈면에 교정 통치자를 놓습니다.
- 필요한 경우 현미경 초점을 맞 춥니 다.
- 마우스를 사용하여 두 개의 스케일 바 사이에 선을 그립니다.
- 2 단계. 보도 "계산"버튼을 표시 상자에 거리를 입력합니다.
- "십자"탭을 클릭합니다. 1 모터 속도를 켭니다.
- 헤드 어셈블리에 xScisor를 삽입합니다. "z 축"버튼을 누름으로써, Z 축 준비 위치로 니더 헤드 조립체. 참고 : 헤드 어셈블리 베스트 해부 악기의 큰 구조입니다. xScisor이 문서의 나머지 부분에 대한 소비 밀 비트라고한다.
- 조이스틱 버튼을 "해부 참여"를 클릭합니다. 참고 :이 버튼이 조이스틱의 상단에 위치하고 있습니다.
- 시각적으로 회전 중심을 정의합니다. 이렇게하려면 정의하여 회전 중심에 십자선의 중심을 이동프로그램의 1 단계에서 d 매개 변수. 십자선을 정렬하는 픽셀을 조정하기 위해 "X"와 "Y 축"바에서 아래 화살표를 사용합니다. "완료"탭을 클릭합니다.
- "홈"아이콘을 클릭합니다. 참고 :이 작업은 오른쪽 상단 모서리에있는 집 이미지로 표현된다.
2. 참조 이미지 만들기
- 무대에서 H & E 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 상단에 불투명 커버를 놓습니다. H & E 슬라이드의 원하는 영역에 조이스틱을 움직여서 기기를 구동한다. 생성 된 이미지를 저장합니다. 참고 : "캡처 참조"탭 또는 "해부"탭 하나가이 단계를 완료하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 해부를 위해 조직을 맞 춥니 다
- 홈 화면에서 "조직을 해부"옵션을 클릭합니다.
- "연산자", "해부 접근 번호", "참조 기탁 번호", "xScisor 바코드 번호,"& #을 입력합니다8220; 해부 유체 로트 번호 ","xScisor 크기 "및"설정 "탭에서"설명 ".
- "조직을 찾아"탭을 클릭합니다.
- 가져 오기 이전에 참조 이미지를 저장.
- 무대에서 5 미크론 두께의 흠 FFPE 슬라이드를 놓습니다. 참조 화상에 도시 한 것과 같은 영역으로 스테이지를 이동. "이미지 삽입"탭을 클릭합니다.
- "정렬"탭을 클릭합니다. 흠없는 이미지에 대한 참조 이미지를 정렬하는 마우스와 관련된 화살표를 사용합니다.
4. 슬라이드에 주석 달기
- "주석"탭을 클릭합니다.
- microdissected 될 슬라이드의 원하는 영역 주위에 원을 그리려면 마우스를 사용합니다.
5. 소모품 밀 비트로드
- 유체 운동에 위아래로 여러 번 플런저를 잡아 당겨, 여기에 원하는 버퍼, PKD 버퍼와 소모품 밀 비트를 입력합니다. 반드시 공기를 제외 할 수 있도록거품.
- "Z-축"버튼을 눌러 Z 축 올립니다.
- 기계로 소비 밀 비트를 넣습니다. 기계의 정상에 소비 밀 비트를 슬라이딩하여이 작업을 수행 할 있도록 소모품 밀 비트에 검은 색 줄까지 기기 라인에 흰색 선. 플런저가 올바른 위치로 낮출 수 있도록 압박 "포부 리셋"버튼을 클릭합니다. 참고 : 소모품 밀 비트를 밀어 쉽게해야합니다. 그렇지 않은 경우, 노치가 제대로 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 다시 "Z 축"단추를 눌러 니더 Z 축.
6. 조직을 해부하다 (그림 4)
- "해부"탭을 엽니 다.
- 1 모터와 흡입 속도를 켭니다.
- "쇼 추적"확인란을 선택합니다. 주의 : 이는 사용자가 박리 공정 동안 해부 영역을 시각화 할 수있다.
- 해부 할 준비가 완료되면, 버튼을 "참여"뿐만 아니라 "대기음 & # 계속 보유8221; 버튼 조직을 절개하기 위하여 반 시계 방향으로 조이스틱을 이동시키면서.
- 대기음이 "전체"탭이 빨간색으로 변합니다 때까지 반 시계 방향으로 절개를 계속합니다.
7. 소모품 밀 비트를 비우고 제거
- 소모품 밀 비트의 끝에서 0.5 μL의 미세 원심 분리 튜브를 놓습니다.
- 을 눌러 "열망"제어봉 신속의 미세 튜브에 샘플을 꺼냅니다.
- 사용되는 소모품 밀 비트를 배출 증가 힘으로 누르십시오.
- 플런저를 다시 잡아 당겨 조직 조각을 씻어. 소모품 밀 비트에 남아있는 샘플을 표현하기 위해 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다. 조직 조각은 지금의 미세 튜브에 포함됩니다.
열 처리하여 테 K 소화 8.를 Lyse 샘플
- 조직 샘플을 복구하는 단백질 분해 효소 K의 5 μg을 포함 70 μL의 TE 산도 8.5을 추가합니다.
- 프로그램 히터 통에 샘플을 놓고.
- 다음 설정에서 프로그램 히터 통을 사용하여 완전한 소화 : 1,500 rpm에서 30 분 동안 60 ˚ C; 1,500 rpm에서 15 분 동안 82 ˚ C; 450 rpm에서 1 분간 25 ˚ C. 샘플은 현재 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다.
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Representative Results
상기 프로토콜은 FFPE 조직 슬라이드에서 RNA를 추출하는 새로운 mesodissection 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 효능은 다양한 감염 단계에서 Mtb의 감염 NHP에서 폐 육아종의 FFPE 슬라이드를 통해 표시됩니다. 1-3 악기. 그림 4의 이미지 들이고 해부 프로세스가 발생하는 방법을 묘사하고 소프트웨어. 표 1에 의해 생성 된 결과 이미지 각각의 감염 상태에서 NHP에서 육아종와 RNA 추출의 결과를 보여줍니다. RNA가 증폭 및 16S (표 2-4)의 RT-PCR 증거를 허용하도록 정제 하였다. 표 4 따라서 Mtb의 리보솜 소단위 16S의 존재를 확인하고, 상기 Mtb, microdissected 샘플.
조이스틱을 포함 mesodissection 악기 1. 이미지를 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. mesodissection 악기의 가까이보기. "z 축"버튼, "모터"속도 "열망"속도 노브는 이미지의 왼쪽에 표시됩니다. "흡인기 리셋 버튼"및 "on / off"버튼 화상의 우측에 도시된다. 슬라이드 단계는 기기의 상단에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 조이스틱의 가까이보기. 조이스틱, "대기음 펄스"와 같이 "단계 속도"버튼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NHP의 EB23에서 mesodissected 전체 육아종의 그림 4. 보고서는. 본 연구에서 사용 된 동물은 에어로졸을 통해 CDC1551 MTB에 감염되었다. 왼쪽의 참조 이미지는 적극적으로 감염 붉은 털 원숭이 짧은 꼬리 원숭이에서 H & E 염색 육아종을 보여줍니다. 해부 관심을 원하는 지역은 녹색으로 설명되어 있습니다. 중간 웃음의 이미지WS 해부하기 전에 5 미크론 두께의 대응 흠 FFPE 슬라이드. 영역은 소프트웨어를 사용하여 정렬하고, 그 상관 관계 영역은 녹색으로 설명되어 있습니다. 오른쪽 이미지는 같은 흠 FFPE 슬라이드 포스트 해부를 보여줍니다. 해부 지역은 파란색으로 표시됩니다. 400mm 2 소모품 밀 비트는 큰 절개 영역 매체의 이송 해부를 위해 설계 절개에 사용되었다. 큰 절개 영역은보다 100mm 2로 설명되어 있습니다. 다른 지역 / 해부 유형의 디자인 크기를 사용할 수 있습니다. 보고서는 0mm 2로 주석 영역을 설명하지만,이 부정확합니다. 우리가 기계에서 microdissected 슬라이드를 제거하고 물리적으로 관심 자체의 영역에서 볼 때, 우리는 더 이상 조직을 가지고 있으며, 따라서 절개 한 슬라이드에서 해당 지역을 볼 수 있습니다. 그것은 저자는 악기를 임대하는 것을 주목해야한다이 문제는 다른 용 기기에 고정 된국세청. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 대주교 | 감염 상태 | NG / μL의 RNA 농도 | NG 총 RNA | 280분의 260 | 230분의 260 |
| EB23 | 활동적인 | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | 숨어있는 | 61.4 | (921) | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | SIV와 공동 감염을 통해 활성화 | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
표 1. RNA 농도는 추출을 게시 할 수 있습니다. 샘플 DNAsed시키고 RNA 추출은 Qiagen 사 RNAeasy FFPE 키트를 사용하여 실시 하였다. RNA 콘centration는 nanodrop를 사용하여 얻었다. NHP의 감염 단계도 그려져있다. RNA 15 ㎕의 RNAse가없는 물에 용출 하였다.
| 대주교 | 감염 상태 | NG / μL의 cDNA의 농도 | NG 총의 cDNA | 280분의 260 | 230분의 260 |
| EB23 | 활동적인 | 31.7 | (951) | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | 숨어있는 | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | SIV와 공동 감염을 통해 활성화 | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
표 2.의 cDNA 농도는 증폭 및 정화를 게시합니다. NHP의 감염 단계도 그려져있다. RNA는 박수 RNA-시퀀서 FFPE 시스템 (부품 N을 사용하여 증폭오. 7150)와 증폭 된 cDNA를 발생하는 증폭 시스템의 사용 설명서의 26 페이지의 Nugen에 의해 제안 QIAGEN 제품, QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제 하였다. cDNA를 30 ㎕의 TE 완충액으로 용출되었다.
| 잘 | 신고자 | CT | TM 값 |
| 16S 10-1 | 표준 | 12.35138 | 79.4 |
| 16S 10-2 | 표준 | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10-3 | 표준 | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10-4 | 표준 | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10-5 | 표준 | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10-6 | 표준 | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | 알 수없는 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | 알 수없는 | 17.760149 | 78 |
| EB23 | 알 수없는 | 24.754618 | 78.2 |
| 음성 대조군 | NTC | 33.544422 | 79.7 |
표 3. RT-PCR은 16 전투기에 대한 리보솜 소단위로 발생합니다. 따라서 샘플 내에서 결핵균의 존재를 증명 관찰 적절한 증폭. CDC1551 Mtb의 균주로부터 게놈 DNA를 표준으로 사용 하였다.
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Discussion
Mesodissection 병원균의 광대 한 배열로 인한 병적 병변 슬라이드로부터 RNA 추출에 적용 할 수있는 기법이다. 이것은 사용자가 콘텐츠를 추적하고 정확하게 이미지를 정렬 필요성이다. 이 작업을 수행하기 위해 장비는 이미징 소프트웨어의 지침에 따라 보정해야합니다. 해부 할 때 해부하고 그 슬라이드와 영역이 정렬되지 않는 경우, 사용자는 장비를 다시 교정해야합니다. 해부 과정에서 또 다른 중요한 단계는 이전의 해부 (5.1 단계)에 거품이없는 상태가되도록하는 방식으로 소비 밀 비트를로드하는 것입니다. 우리는 거품의 존재가 해부 수율을 감소한다는 것을 발견했다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 여러 번 추진과 플런저를 표현하는 것이 좋습니다. 사용자는 제조업체에서 권장하는, 거품을 시각화하는 연습 버퍼에 식용 색소를 추가하여 연습 할 수 있습니다. 유효하면, 사용자는 통상의 절개를 진행한다. 라세인트 중요한 단계는 반 시계 방향으로 샘플을 해부하는 것입니다. 반 시계 방향의 기계 선반; 따라서, 우리는 반대 방식으로 원을 그리 조이스틱을 이동하는 더 깨끗하게 트레일 링 에지 (6)보다 첨단 컷으로 조직의 수율을 증가 시킨다는 것을 발견했다. 티슈 수율을 개선하는 또 다른 방법은 박리 과정의 속도를 감소시키는 것이다. 우리는 동시에 "낮은"최고 조직의 수율을 생산하는 단계 속도를 설정하는 동안 최저 속도에 대한 열망 속도와 모터 속도를 설정하는 것으로 나타났습니다. 이 미세 절제 방법에 두 가지 제한 사항이 있습니다. 첫 번째 한계는 우리가 인해 해부 과정에서 반 시계 방향으로 원을 조이스틱을 구동 할 필요가 가리킨 해부는 매우 어려운 발견 한 것입니다. 두 번째 제한은 악기의 카메라는 고급 현미경에서 생성 된 이미지의 셀 내용이 부족하여 이미지를 생성하는 것입니다.
결핵균 transcriptomic 분석에 대한 직접적인 영향을 미칠 수있다. 육아종 형성 결핵 감염과 폐 5의 제한된 지역 내에서 병원체를 포함하는 호스트의 시도의 결과의 특징이다. 반대로, 그것은 MTB를이. Mtb의이 감염의 단계에 따라 서로 다른 응력을 실시 육아 종성 병변 7의 지속성을 할 수 있도록 진화 것을 제안되었다. 이러한 스트레스 중 일부는하지만, 등 7-13 산화 환원 스트레스, 낮은 pH, 막 손상, 저산소증, 영양 부족, 제한되지 않는다. 이러한 여러 단계에 걸쳐 Mtb의 여전히 잠재 형태로 생존도 활성화 할 수 있습니다. 이것은 서로 다른 유전자가 상향 조절 및 다른 감염 단계에서 하향 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, Mtb의 200 이상 전사 인자 4 인코딩합니다. 또 다른 케모카인 사이 식 밸런스, suc에 것으로 나타났다육아종 내에서 α와 β 케모카인, 같은 시간이 중요한 보호 마커 8 일 수있다. 육아 종성 조직에서 마이코 박테리아 transcriptomics의 평가는 감염의 각 상태로 표현되는 자신의 형성에 관여 메커니즘 및 유지 보수뿐만 아니라, 그 유전자에 대한 우리의 이해를 증진 할 가능성이있다. 이것은 우리가, 활성 잠재 및 활성화 질병뿐만 아니라 육아종 자체 내 다양한 지역을 포함하는 다양한 TB 감염 단계에있는 결핵균 transcriptomics을 평가 할 수 있습니다. 우리는 상기 마이코 박테리아 transcriptomics을 평가할 수있을뿐만 아니라, 위의 절차는 동일 감염 상태에서 호스트 transcriptomics의 평가를 허용한다. 또한,이 방법은 호스트와 박테리아의 관계를 비교, 대조하고, 분석 할 수있다.
TB 연구에서 중요한 도구이지만, 전술 한 프로토콜뿐만 아니라 다른 병원균에 적용될 수있다. 위의프로토콜은 감염된 폐 샘플로부터 FFPE 슬라이드를 사용하지만, 다른 기관에서의 병변에 적용될 수있다. 우리는 RNA를 추출하는 시스템을 사용하는 방법을 설명하지만, 이론적으로 동등한 효과와 시간에 민감한 방식으로 DNA 및 단백질 추출을 위해 사용될 수있다. FFPE 블록은 대부분의 실험실 조직학 부서에서 사용할 수 있습니다; 따라서, 여기에 설명 된 기술은 기하 급수적 현재 미사용 샘플로부터 얻은 지식을 증가의 가능성이있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 개시한다.
Acknowledgments
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, 및 P51OD011104 : 저자는이 연구의 지원에 대해 다음 NIH 상 / subawards을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M.
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Tags
면역학 제 88 미세 절제 mesodissection 포르말린 고정 파라핀,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
