Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide
Summary
This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.
Abstract
In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner. Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.
Introduction
De toepassing van elektrische stroom aan een cel leidt tot de vorming van poriën in het celmembraan, een werkwijze genoemd elektroporatie. De poriën laten de passage van verschillende nonpermeant moleculen door het membraan. Het elektrische veld kan nauwkeurig worden geregeld, zodat de poriën gevormd zijn erg klein en hersluiten snel, met minimale verstoring van de cellulaire fysiologie. Interessant is dat hechtende cellen worden gekweekt op een glasplaatje gecoat met geleidend en transparant indium-tin oxide (ITO) en geëlektroporeerd in situ, dat op het oppervlak waar ze groeien, zonder los te geëlektroporeerd in suspensie. Cellen kunnen goed groeien op dit oppervlak, en als deze zijn bevestigd en uitgebreid, gedetailleerde microscopische waarneming mogelijk. Met deze techniek kunnen kleine nonpermeant moleculen direct worden ingevoerd en in wezen 100% van de cellen, dat deze techniek bijzonder geschikt voor studies op de activatie van beeld metonents van een traject na ligand stimulatie van een receptor (beoordeeld in 1).
Elektroporatie wordt meestal gebruikt voor de introductie van DNA (ook wel electrotransfection). Echter, elektroporatie in situ waardevol voor de invoering van een grote verscheidenheid van moleculen, zoals peptiden 2-4, oligonucleotiden zoals antisense RNA, dubbelstrengs DNA decoy-oligonucleotiden kunnen remmen transcriptiefactor binding of siRNA 3,5, 6, radioactieve nucleotiden 7-10, eiwitten 11 12 of pro-drugs 13. Na elektroporatie, kunnen cellen worden gelyseerd voor biochemische analyses en gefixeerd en gekleurd met antilichamen.
De geleidende ITO coating is zeer dun, 800-1,000Å, waardoor celgroei niet wordt verstoord door het hoogteverschil van de twee oppervlakken, als de cellen groeien over de rand van de geleidende coating. Dit biedt het voordeel dat niet-electroporated cellen kunnen worden gekweekt zij aan zij met geëlectroporeerd degenen, om te dienen als controle. Dezelfde benadering kan worden gebruikt voor het onderzoek van spleetovergangen, intercellulaire communicatie (GJIC), zoals beschreven in de Video.
Gapjuncties zijn kanalen verbinden het interieur van aangrenzende cellen 14. Spleetovergangen, intercellulaire communicatie speelt een belangrijke rol in tumorvorming en metastase, terwijl oncogenen zoals Src onderdrukken GJIC 15,16. Om GJIC onderzoeken van een fluorescente kleurstof zoals Lucifer geel (LY) wordt vaak geïntroduceerd in gekweekte cellen door micro-injectie of schrapen laden 17 en de diffusie van de kleurstof in naburige cellen microscopisch waargenomen onder fluorescentieverlichting. Deze technieken echter steeds celbeschadiging veroorzaken. We beschrijven nu een techniek waarbij cellen worden gekweekt op een glasplaatje dat gedeeltelijk bedekt met ITO 18. Een elektrische puls wordt toegepast in aanwezigheid van LY (of andere kleurstoffen) camet de penetratie in de cellen groeien op het geleidende deel van de schuif, terwijl kleurstofmigratie van de aangrenzende, niet-geëlektroporeerde cellen microscopisch waargenomen door fluorescentieverlichting. Om storende gevoelige cellen die de neiging hebben los te maken van de monolaag te voorkomen, een samenstel is gemaakt dat geen elektrode nodig was om bovenop de cellen voor toepassing van de elektrische stroom 19 worden geplaatst. Deze benadering biedt de mogelijkheid om GJIC kwantificeren in een groot aantal cellen, zonder meetbare verstoring van cellulair metabolisme, zoals aangegeven door de afwezigheid van een effect op de lengte van de G1 fase na stimulatie serum 12, verhoging in de niveaus van de fos protooncogen eiwit (Raptis, ongepubliceerd) of twee kinasen geassocieerd met cellulaire stress, de p38 varken of JNK / SAPK kinase 1. Deze aanpak kan het onderzoek van het verband tussen de niveaus van oncogene expressie, transformatie en GJ gemaaktIC 18, en het effect van Src en Stat3 op GJIC in verschillende celtypen, waaronder vers gekweekte cellen van long tumor specimens 20-23. Bovendien, in situ elektroporatie met de instellingen beschreven die een bovenste elektrode is met succes toegepast voor het aantonen van gap junction sluiting tijdens adipocytic differentiatie mist, hoewel cellulaire hechting aan het substraat wordt verkleind dat stadium 19,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Geëlektroporeerde materiaal
De zuiverheid van het materiaal dat moet worden geëlektroporeerd is heel belangrijk. Als de cellen zeer vlak, moet dan hogere concentraties van de tracking kleurstof worden (tot 20 mg / ml voor LY) en in dergelijke gevallen zuiverheid nog belangrijker dan in cellen met een bolvorm 1. Naast LY een grote verscheidenheid aan andere kleurstoffen of nonpermeant moleculen zijn gebruikt, zoals een reeks…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Referências
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
