This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.
In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner. Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.
L'application d'un courant électrique à une cellule provoque la formation de pores de la membrane de la cellule, par un processus appelé électroporation. Les pores permettent le passage d'une variété de molécules à travers la membrane nonpermeant. Le champ électrique peut être commandée avec précision, de sorte que les pores formés sont très petites et se referment rapidement, avec un minimum de perturbation de la physiologie cellulaire. Fait intéressant, les cellules adhérentes sont cultivées sur une lamelle de verre revêtue d'oxyde d'indium-étain conductrice et transparente (ITO) et une électroporation in situ, qui se trouve sur la surface, où elles poussent, sans se détacher à une électroporation en suspension. Les cellules peuvent se développer très bien sur cette surface, et comme ils sont attachés et étendus, l'observation microscopique détaillée est possible. En utilisant cette technique, de petites molécules peuvent être introduites nonpermeant directement et essentiellement en 100% des cellules, ce qui rend cette technique particulièrement appropriée pour des études sur l'activation de la components une voie de stimulation suivantes ligand d'un récepteur (revue dans 1).
L'électroporation a été utilisé principalement pour l'introduction d'ADN (également appelé électrotransfection). Cependant, l'électroporation in situ peut être utile pour l'introduction d'une grande variété de molécules, telles que des peptides, des oligonucléotides 2-4, tels que l'ARN antisens, des oligonucleotides double brin de l'ADN leurre pour inhiber la liaison du facteur de transcription, ou siRNA 3,5, 6, 7-10 nucléotides radioactifs, des protéines 11 12 ou pro-médicaments 13. Après l'électroporation, les cellules peuvent être lysées par des analyses biochimiques ou fixées et colorées avec des anticorps.
Le revêtement d'ITO conductrice est très mince, 800-1,000Å, de sorte que la croissance de la cellule n'est pas perturbée par la différence de hauteur des deux surfaces, comme les cellules se développent à travers le bord de la couche conductrice. Ceci offre l'avantage que le non-electropfilmée cellules peuvent être cultivées à côté de ceux électroporation, pour servir de témoins. La même approche peut être utilisée pour l'examen des jonctions lacunaires, la communication intercellulaire (GJIC), comme décrit dans la vidéo.
Les jonctions lacunaires sont des canaux reliant les intérieurs des cellules adjacentes 14. Gap jonction, la communication intercellulaire joue un rôle important dans la formation des tumeurs et des métastases, alors que les oncogènes Src telles que supprimer GJIC 15,16. Pour examiner GJIC un colorant fluorescent tel que le jaune Lucifer (LY) est souvent introduit dans des cellules en culture à travers la micro-injection ou gratter de chargement 17 et de la diffusion du colorant dans les cellules voisines est observée au microscope sous éclairage fluorescent. Ces techniques mais provoquent invariablement des dommages cellulaires. Nous décrivons maintenant une technique dans laquelle les cellules sont cultivées sur une lamelle de verre, qui est partiellement revêtue d'ITO 18. Une impulsion électrique est appliquée en présence de LY (ou d'autres colorants) cal'aide de sa pénétration dans les cellules en croissance sur la partie conductrice de la glissière, tandis que la migration de colorant aux cellules adjacentes, non électroporation a été observée au microscope par l'illumination de fluorescence. Pour éviter que les cellules sensibles perturbateurs peuvent avoir tendance à se détacher de la monocouche, un ensemble a été conçu qui ne nécessite pas une électrode à être placé au-dessus des cellules pour appliquer le courant électrique 19. Cette méthode offre la possibilité de quantifier GJIC dans un grand nombre de cellules, sans aucune perturbation détectable pour le métabolisme cellulaire, comme indiqué par l'absence d'un effet sur la durée de la phase G1 suite à une stimulation de sérum 12, l'augmentation des niveaux de la fos protéine oncogène (Raptis, non publié) ou deux kinases associées au stress cellulaire, le porc de p38 ou JNK / SAPK kinase 1. Cette approche rendue possible l'examen du lien entre les niveaux d'expression oncogène, la transformation et GJIC 18, ainsi que l'effet de la Src et Stat3 sur GJIC dans une variété de types de cellules, y compris des cellules fraîchement cultivées à partir d'échantillons de tumeur du poumon de 20 à 23. En outre, dans l'électroporation in situ avec la configuration décrite qui manque une électrode supérieure a été utilisé avec succès pour la démonstration de l'écart jonction lors de la différenciation adipocytaire fermeture, bien que la fixation cellulaire au substrat est réduite à ce stade 19,24.
Les étapes critiques dans le protocole
Matériau électroporation
La pureté de la matière à une électroporation est très important. Si les cellules sont très plates, des concentrations plus élevées alors du colorant de suivi doivent être utilisés (jusqu'à 20 mg / ml pour LY) et dans de tels cas, la pureté est encore plus important que dans les cellules avec une forme plus sphérique 1. Outre LY une grande variété d'autres colorants ou d…
The authors have nothing to disclose.
We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen’s University.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |