جيل وتنقية الإنسان INO80 ونين إعادة عرض مجمعات وSubcomplexes
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء لتوليد وتنقية النوع البري والإصدارات متحولة من مجمع INO80 إعادة عرض الكروماتين البشري. حاتمة الموسومة يتم التعبير عن إصدارات مفارز INO80 مستقر في خلايا HEK293، ويتم تنقية المجمعات والمجمعات كاملة تفتقر إلى مجموعات محددة من قبل مفارز immunoaffinity اللوني.
Abstract
INO80 المجمعات الكروماتين إعادة تنظيم ديناميات النيوكليوسومات والحمض النووي الوصول عن طريق حفز ATP التي تعتمد على إعادة جسيم نووي. تتكون المجمعات INO80 الإنسان من 14 مفارز البروتين بما في ذلك Ino80، وهو SNF2 مثل أتباز، الذي يخدم على حد سواء كما الوحيدات الحفازة وسقالة لتجميع المجمعات. مهام مفارز الأخرى والآليات التي تساهم في إعادة النشاط لونين مجمع INO80 وتبقى غير مفهومة، ويرجع ذلك جزئيا إلى التحدي المتمثل في توليد التجميع الثانوي INO80 في الخلايا البشرية أو أنظمة تعبير مغايرة. يصف هذا البروتوكول إن الرب إجراء من شأنه أن يسمح تنقية INO80 الكروماتين subcomplexes إعادة البشري التي تفتقر حدة فرعية أو مجموعة فرعية من الوحدات الفرعية. الموسومة N-عضال حاتمة FLAG يتم تقديمها Ino80 [كدنا مستقر في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293 خطوط الخلايا باستخدام FLP بوساطة إعادة التركيب. في حالة عدم وجود فرعية من مفارز مجمع INO80 هي بالبريد حذفها، واحد عن البروتينات Ino80 بدلا متحولة التي تفتقر إلى منصة اللازمة لتجميع تلك الوحدات الصغرى. في حالة وحدة فرعية الفردية هي أن تنفد، واحدة transfects الرناوات siRNAs تستهدف هذه الوحدة الفرعية إلى خط الخلية HEK 293 التعبير عن ثابت FLAG الموسومة Ino80 أتباز. يتم إعداد مقتطفات النووية، ويتم تنفيذ FLAG مناعي لإثراء الكسور البروتين تحتوي على مشتقات Ino80. ويمكن بعد ذلك يتم تحليل التراكيب من subcomplexes INO80 تنقيته باستخدام أساليب مثل immunoblotting والفضة تلطيخ، ومطياف الكتلة. وINO80 وINO80 subcomplexes المولدة وفقا لهذا البروتوكول يمكن تحليلها باستخدام مختلف المقايسات الحيوية، والتي تم وصفها في البروتوكول إن الرب المصاحب. الأساليب المذكورة هنا يمكن تكييفها للدراسات من الخصائص الهيكلية والوظيفية في أي الثدييات فرعية متعددة الكروماتين إعادة عرض والمجمعات تعديل.
Introduction
الحفظ تطويريا المجمعات إعادة عرض الكروماتين الأسرة SNF2 هي المنظمين الرئيسيين للتنظيم الكروماتين وDNA الوصول 1. إعادة عرض هذه المجمعات تشمل دائما مثل SNF2 أتباز فرعية المركزية، التي،، يجمع في بعض الحالات مع مختلف البروتينات الإكسسوارات وتشكل فرعية متعددة، الجمعيات الكلي الجزيئية. لدراسة التفاصيل الجزيئية لعملية إعادة عرض الكروماتين تعتمد على ATP، فمن المهم أن نفهم مساهمات مجموعات فرعية معينة من الوحدات الفرعية و / أو هياكل المجال لأنشطة المجمعات. مثل هذه التحليلات تتطلب القدرة على توليد المجمعات متحولة العالية النقاء التي تفتقر إلى البروتين مفارز معينة أو هياكل المجال.
وقد ركزت الدراسات السابقة هيكل وظيفة من ATP التي تعتمد على المجمعات الكروماتين إعادة عرض على نطاق واسع في النظام النموذجي الخميرة بسبب manipulability متفوقة من الجينوم الخميرة (انظر، على سبيل المثال، الحكام 1-4). نظرا لصونتكوين فرعية والوظائف بين المجمعات إعادة orthologous، قدمت دراسات لهيكل وظيفة من المجمعات إعادة الخميرة نظرة ثاقبة على نظرائهم في حقيقيات النوى أعلى. ومع ذلك، لا توجد أنواع محددة ملموسة الخلافات بين المجمعات إعادة عرض، الناتجة عن المكسب أو الخسارة من أنواع محددة مفارز، ربح أو خسارة من المجالات أنواع محددة من مفارز المحفوظة، وتقلب تسلسل ضمن مجالات الحفظ مفارز المحفوظة. من حيث المبدأ يمكن أن يكون الدافع وراء هذه الاختلافات بسبب الحاجة للخلايا حقيقية النواة أعلى على التكيف مع بيئات الجزيئية والخلوية الجديدة. وبالتالي، فإن فهم كيفية مساهمة مفارز من أعلى المجمعات إعادة حقيقية النواة لعملية إعادة النيوكليوسومات هو قيمة، لأنه يسلط الضوء ليس فقط على الآليات الأساسية لعملية إعادة عرض الكروماتين ATP-تعتمد، ولكن أيضا يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الآليات التي بنية الكروماتين والتعبير الجيني في اثوينظم حقيقيات النوى لها.
حتى الآن، كانت هناك فقط تقتصر الدراسات البنيوية والوظيفية متعددة فرعية-الثدييات المجمعات إعادة عرض الكروماتين، ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات في الحصول على تعريفها كيميائيا الكروماتين المجمعات إعادة عرض وsubcomplexes. لقد التحايل جزئيا على هذه الصعوبات مع الإجراءات الموضحة أدناه، والذي يستخدم في تنقية immunoaffinity لإعداد سليمة INO80 أو INO80 subcomplexes من خلايا الإنسان التعبير عن ثابت N-عضال FLAG حاتمة الموسومة النوع البري أو الإصدارات متحولة من Ino80 5-7 (الشكل 1) . للحصول على المجمعات INO80 سليمة من الخلايا البشرية، ويستخدم FLP بوساطة إعادة التركيب لتوليد خطوط الخلايا المعدلة وراثيا HEK293 التعبير عن ثابت حاتمة FLAG cDNAs الموسومة ترميز مفارز مجمع INO80 8-10. لأن الإفراط في التعبير عن مفارز INO80 يمكن أن تكون سامة إلى حد ما، فمن الضروري عزل والحفاظ على خطوط الخلايا نسيلي تحت شارك انتقائيةnditions لضمان استقرار التعبير التحوير خلال العديد من الممرات اللازمة للتوسع في مزارع الخلايا على نطاق واسع. للحصول على subcomplexes INO80 أصغر التي تحتوي على مجموعة فرعية فقط من الوحدات الفرعية، وقد استخدمنا بنجاح النهجين (الشكل 2A، B). في البداية، وتوليد HEK293 FLP-في خطوط الخلايا معربا عن ستابلي الإصدارات متحولة من Ino80 التي تفتقر المجالات المطلوبة للتفاعل مع وحدات فرعية محددة 5. بدلا من ذلك، يستخدم ضربة قاضية سيرنا بوساطة في استنزاف الوحيدات المطلوب من خلايا إبداء الموسومة FLAG INO80 فرعية المناسبة (بيانات غير منشورة). أخيرا، لتنقية المجمعات INO80 الإنسان، يتم استخدام FLAG اللوني القائم الاغاروز 11 إلى إثراء جزء التي تحتوي على مقتطفات من INO80 النووية، وبالتالي الحد من فعالية وجود تلوث البروتينات عصاري خلوي في جزء نهائي يتضمن النقي INO80 أو INO80 subcomplexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أعاق الدراسات البنيوية والوظيفية متعددة فرعية المجمعات الثدييات الكروماتين إعادة عرض من حقيقيات النوى أعلى من صعوبة إعداد كيميائيا كميات مفيدة من هذه المجمعات التي تحتوي على وحدات فرعية متحولة أو تفتقر إلى بعض مفارز تماما. هناك عدد من العقبات الفنية: أولا، كان ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم العمل في المختبر المؤلفين من خلال منحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (GM41628) ومنحة لمعهد نيفيز للبحوث الطبية من صندوق البحوث الطبية نيلسون هيلين في مؤسسة المجتمع كانساس سيتي الكبرى.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Referências
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
