Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Wildtyp-und Mutantenversionen der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexes. Epitop-markierte Versionen der INO80 Untereinheiten stabil in HEK293-Zellen exprimiert, und die Gesamtkomplexe und Komplexe ohne spezifische Sätze von Untereinheiten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt.
Abstract
INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe regulieren Nukleosomen Dynamik und DNA-Zugänglichkeit durch Katalyse ATP-abhängigen Nukleosomen Umbau. Menschliche INO80 Komplexe aus Protein-Untereinheiten 14 einschließlich INO80 eine SNF2 artigen ATPase, die sowohl als die katalytische Untereinheit und dem Stützgerüst zur Montage der Komplexe dient. Funktionen der anderen Untereinheiten und die Mechanismen, durch die sie den INO80 Komplexes Chromatin-Remodeling-Aktivität beitragen noch schwer, was zum Teil auf die Herausforderung der Erzeugung INO80 Baugruppen in menschlichen Zellen oder heterologen Expressionssystemen. Dieses Protokoll beschreibt JOVE eine Prozedur, die die Reinigung der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling Subkomplexe, die eine Untereinheit fehlt oder eine Teilmenge der Untereinheiten ermöglicht. N-terminal FLAG-Epitop markiert INO80 cDNA stabil in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293-Zelllinien mit Flp-vermittelte Rekombination eingeführt. In dem Fall, dass eine Untergruppe von Untereinheiten des Komplexes ist INO80 zu be gelöscht, statt einer Mutante INO80 Proteine, die die Plattform für die Montage dieser Untereinheiten sind, nicht immer zum Ausdruck bringt. Im Falle eine individuelle Untereinheit ist erschöpft sein, eine Transfekte siRNAs dieser Untereinheit in ein HEK 293-Zelllinie, die stabil FLAG getaggt INO80 ATPase. Kernextrakte werden hergestellt und FLAG Immunpräzipitation durchgeführt, um die Proteinfraktionen, die INO80 Derivate bereichern. Die Zusammensetzungen gereinigt INO80 Subkomplexe kann dann unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise Immunoblotting, Silberfärbung und Massenspektrometrie analysiert werden. Die INO80 und INO80 Subkomplexe entsprechend diesem Protokoll erzeugt wird, kann weiter analysiert werden unter Verwendung von verschiedenen biochemischen Tests, welche in den beiliegenden JOVE Protokoll beschrieben sind. Die hier beschriebenen Methoden können für die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften einer Säuger mehreren Untereinheiten Chromatin-Remodeling-Komplexe und Modifikation angepasst werden.
Introduction
Evolutionär konservierte Familie SNF2 Chromatin-Remodeling-Komplexe sind Schlüsselregulatoren des Chromatins Organisation und DNA-Zugänglichkeit 1. Diese Umbau-Komplexe schließen immer eine zentrale SNF2 artigen ATPase Untereinheit, die in einigen Fällen, montiert mit verschiedenen Zubehör Proteine und bildet mit mehreren Untereinheiten makromolekulare Baugruppen. Um die molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess zu untersuchen, ist es wichtig, die Beiträge der gegebenen Untermengen von Untereinheiten und / oder den Domain-Strukturen Aktivitäten der Komplexe zu verstehen. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit, hoch gereinigten Mutante Komplexe, insbesondere Protein-Untereinheiten oder Domänenstrukturen fehlt erzeugen.
Vorherige Struktur-Funktions-Studien von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexe sind allgemein für die Hefe-Modellsystem fokussiert aufgrund der überlegenen Handhabbarkeit des Hefe-Genom (siehe zB Lit. 1-4). Angesichts der Erhaltung derZusammensetzung Einheit und Funktionalität unter ortho-Remodeling-Komplexe, Untersuchungen der Struktur und Funktion der Hefe-Remodeling-Komplexen haben wichtige Einblicke in ihre Gegenstücke in höheren Eukaryoten ist. Dennoch nennenswerte Spezies-spezifische Unterschiede zwischen den Umbau Komplexe existieren, von Gewinn oder Verlust der Spezies-spezifische Untereinheiten, Gewinn oder Verlust der Arten-spezifische Domänen von konservierten Untereinheiten und Sequenzvariabilität innerhalb konservierten Domänen von konservierten Untereinheiten entstehen. Solche Unterschiede können im Prinzip durch die Notwendigkeit für höhere eukaryotische Zellen zu neuen molekularen und zellulären Umgebungen anzupassen angetrieben werden. So verstehen, wie Untereinheiten der höheren eukaryotischen Umbau Komplexe dazu beitragen, die Nukleosomen Umbauprozess ist wertvoll, denn es wirft nicht nur Licht auf die grundlegenden Mechanismen der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess, sondern kann auch wertvolle Einblicke in die Mechanismen, durch die Chromatinstruktur und Genexpression in higsie Eukaryonten reguliert.
Bisher gab es nur strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe, zum Teil aufgrund der Schwierigkeiten bei der biochemisch definiert Chromatin-Remodeling-Komplexe und Unterkomplexe beschränkt. Wir haben teilweise diese Schwierigkeiten mit den unten beschriebenen Verfahren, bei denen Immunaffinitätsreinigung verwendet wird, um intakt INO80 oder INO80 Subkomplexe aus menschlichen Zellen stabil exprimiert N-terminal FLAG-Epitop markierten Wildtyp-oder mutierte Versionen von INO80 5-7 vorzubereiten umgangen (Abbildung 1) . Intakte INO80 Komplexe aus menschlichen Zellen zu erhalten, wird Flp-vermittelte Rekombination verwendet werden, um transgene HEK293-Zelllinien, die stabil FLAG-Epitop markierten cDNAs Untereinheiten des Komplexes INO80 8-10 kodieren, zu erzeugen. Da die Überexpression von INO80 Untereinheiten kann etwas giftig sein, ist es notwendig, zu isolieren und zu pflegen klonalen Zelllinien unter selektiven CoBedingungen ausgebracht, um eine stabile Expression des Transgens in den vielen Passagen für die Erweiterung des Großzellkulturen erforderlich zu gewährleisten. Um kleinere INO80 Subkomplexe, die nur eine Teilmenge der Untereinheiten enthalten, zu erhalten, haben wir erfolgreich verwendet zwei Ansätze (Abbildung 2a, b). In der ersten, erzeugen wir HEK293 Flp-In-Zelllinien, die stabil mutierten Versionen INO80 die Domains für die Wechselwirkung mit spezifischen Untereinheiten 5 erforderlich fehlt. Alternativ wird siRNA-vermittelten Zuschlags verwendet, um die gewünschte Untereinheit von den Zellen eines geeigneten FLAG-markierten INO80 Einheit (unveröffentlichte Daten) Expression führen. Schließlich, um die Menschen INO80 Komplexe zu reinigen, ist FLAG-Agarose-Chromatographie basiert 11 verwendet, um eine INO80 haltigen Fraktion aus Kernextrakten zu bereichern, damit eine effektive Senkung der Anwesenheit von verunreinigenden Cytosolproteine in der letzten Fraktion, die gereinigtes INO80 oder INO80 Subkomplexe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe aus höheren Eukaryoten durch die Schwierigkeit der Herstellung von biochemisch nützlichen Mengen solcher Komplexe, die mutierte oder fehlende bestimmte Untereinheiten Untereinheiten insgesamt behindert. Es gibt eine Reihe von technischen Hürden: Erstens hat die genetische Manipulation in Säugerzellen technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig gewesen. Anders als Hefezellen, deren Genom kann leicht bearbeitet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeit in der Autoren Labor wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences (GM41628) und durch einen Zuschuss an die Stowers Institut für medizinische Forschung von der Helen Nelson Medical Research Fund in der Greater Kansas City Community Foundation unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cellgro | 10-013-CV | |
| Glutamax-I (stablized glutamine) | Life Technologies | 35050-079 | |
| Fetal Bovine Serum | SAFC | 12176C | |
| FuGENE6 transfection reagent | Promega | E2312 | |
| Hygromycin B, sterile in PBS | AG Scientific | H-1012-PBS | |
| pcDNA5/FRT vector | Life Technologies | V6010-20 | |
| Flp-In HEK293 cells | Life Technologies | R780-07 | |
| pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector | Life Technologies | V600520 | |
| EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | F2426 | |
| calf serum | SAFC | 12138C | |
| TARGETplus SMARTsiRNA pool | Dharmacon / Thermo Scientific | various | |
| 5x siRNA resuspension buffer | Dharmacon / Thermo Scientific | #B-002000-UB-100 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 51985-091 | |
| PBS | Cellgro | 45000 | VWR |
| TrypLE (trypsin) | Life Technologies | 12604 | |
| 1x FLAG Peptide | Sigma | F3290 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Column | Bio-Rad | 737-5021 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO) | Amicon | UFC805024 | Fisher Scientific |
| Zeba Desalting Columns | Thermo Scientific | 89882 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, mouse | Sigma | F3165 | |
| Anti-FLAG M2 antibody, rabbit | Sigma | F7425 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| benzonase | Novagen | 70664 | |
| Equipment | Company | ||
| Wheaton Dounce Tissue Grinders | Wheaton | 06-435C | |
| JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge | Beckman-Coulter | 339080 | |
| JA-17 rotor | Beckman-Coulter | 369691 | |
| 10 ml polycarbonate tubes | Beckman-Coulter | 355630 | |
| 70 ml polycarbonate bottles | Beckman-Coulter | 355655 | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | 339160 | |
| Type 70.1 Ti rotor | Beckman-Coulter | 342184 | |
| BD Clay Adams Nutator Mixer | BD Diagnostics | 15172-203 | VWR |
| Glas-Col Tube/Vial Rotator | Glas-Col | 099A RD4512 | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| roller bottle incubator | Bellco biotechnology | 353348 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 |
Referências
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases. Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).
- Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing. Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).
- Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling. Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Sauer, B. Site-specific recombination: developments and applications. 5 (5), 521-527 (1994).
- Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells. Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).
- Cai, Y., et al. YY1 functions with INO80 to activate transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).
- Yao, T., et al. Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex. Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).
- Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques. 16 (4), 730-735 (1994).
- Barker, K. . At the Bench: A Laboratory Navigator. 10, 207-245 (2005).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei. Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).
