Abstract
Scoperta di biomarcatori romanzo gioca un ruolo cruciale nel fornire il rilevamento delle malattie più sensibile e specifica. Purtroppo molti biomarcatori bassa abbondanza che esistono nei fluidi biologici non possono essere facilmente individuati con la spettrometria di massa o immunologici perché sono presenti in concentrazioni molto basse, sono labili, e sono spesso mascherati da proteine ad alta abbondanza, come l'albumina e immunoglobulina. Bait contenente poli (N-isopropilacrilammide) (NIPAM) nanoparticelle a base sono in grado di superare queste barriere fisiologiche. In un passo sono in grado di catturare, concentrare e preservare biomarcatori da fluidi corporei. Analiti basso peso molecolare entrano nel nucleo della nanoparticella e vengono catturati da diversi coloranti chimici organici, che fungono da alta affinità esche proteiche. Le nanoparticelle sono in grado di concentrare le proteine di interesse di parecchi ordini di grandezza. Questo fattore di concentrazione è sufficiente aumentare il livello di proteina tale che le proteine sono all'internolimite di rilevazione di spettrometri di massa attuali, western blotting e saggi immunologici. Le nanoparticelle possono essere incubate con una pletora di fluidi biologici e sono in grado di arricchire notevolmente la concentrazione di proteine a basso peso molecolare e peptidi, escludendo albumina e altre proteine ad alto peso molecolare. I nostri dati mostrano che una piega amplificazione 10.000 nella concentrazione di un particolare analita può essere raggiunto, consentendo spettrometria di massa e test immunologici per rilevare biomarker precedentemente non rilevabili.
Introduction
Nonostante il completamento del sequenziamento del genoma umano, non sono stati compiuti progressi significativi in biomarcatori predittivi di identificazione di malattia in stadio precoce, o che la correlazione con il risultato terapeutico, o la prognosi 1. Uno dei motivi di questa mancanza di progresso è che esistono molti biomarcatori potenzialmente significative ad una concentrazione al di sotto del limite di rilevazione di spettrometria di massa convenzionale e altre piattaforme di scoperta biomarker. La spettrometria di massa (MS) e multipla Reaction Monitoring (MRM) hanno una sensibilità di rilevamento tipicamente superiore a 50 ng / ml, mentre la maggior parte degli analiti misurati da test immunologici caduta laboratorio clinico nell'intervallo tra 50 pg / ml e 10 ng / ml . Questo significa che molti biomarcatori, in particolare nella fase iniziale di una malattia non possono essere rilevati da MS convenzionale e MRM 2. Inoltre la presenza di proteine ad alta abbondanza come albumina e immunoglobuline nei fluidi biologici complessi maschera spesso da miliardi di volte excess bassa abbondanza, proteine a basso peso molecolare e peptidi 3, 4. Per questo motivo sono necessari prima di sequenziamento spettrometria di massa e di identificazione diversi passaggi di preparazione del campione. Un tale passo preparatorio impiega l'esaurimento di proteine di alta abbondanza con colonne di esaurimento disponibili in commercio 5-8. Purtroppo questo passaggio porta alla riduzione del rendimento di biomarker candidati perché sono spesso non covalentemente legato al proteine carrier che vengono rimossi. Un'altra sfida è rappresentata dalla stabilità dei biomarcatori candidati ex-vivo una volta che i campioni vengono raccolti. Le proteine sono soggetti a degradazione da proteasi endogene o esogene 9. Nanoparticelle idrogel possono superare queste sfide critiche amplificando la concentrazione biomarcatore putativo a un livello entro l'intervallo del dosaggio, proteggendo la proteina dal degrado 10-13.
E 'importante notare tha LMW proteine nel sangue sono una miscela di piccole proteine intatte così come frammenti di proteine di grandi dimensioni. Proteine derivate dal tessuto superiore a 60 kDa sono troppo grandi per entrare passivamente il flusso sanguigno attraverso la membrana basale vascolare, ma possono essere rappresentati nel sangue come peptidi o frammenti di proteine 14. Il nostro obiettivo è quello di misurare nuovi biomarcatori circolanti che possono essere candidati per la diagnosi precoce della malattia, stratificazione dei pazienti per la terapia e monitorare la risposta alla terapia. Le nostre nanoparticelle sono creati per escludere selettivamente immunoglobuline alta abbondanza e albumina, e contemporaneamente catturare proteine e peptidi più piccoli e la loro concentrazione fino a 100 volte a seconda del volume di partenza.
Il nostro gruppo ha identificato una serie di piccoli coloranti organici che possono agire con successo esche molecolari ad alta affinità per le proteine e peptidi. Binding protein-dye è pensato per essere a causa di una combinazione di interazione idrofobica ed elettrostaticas. Gli anelli aromatici sulla colorante interleave con proteine tramite tasche idrofobiche sulla superficie della proteina 11.
Le esche, a seconda della loro chimica, mostrano una particolare affinità per le classi selezionate di analiti. Le esche sono in concorrenza con le proteine di trasporto, come l'albumina, per le proteine o peptidi. Il peso proteine / peptidi a basso peso molecolare diventano intrappolati nella particella. Proteine di elevato peso molecolare come albumina e immunoglobuline viene impedito di entrare particella a causa della capacità setacciatura dovuta al poro restrittiva del idrogel 11 (Figura 1).
Nanoparticelle idrogel sono sintetizzati per precipitazione polimerizzazione iniziata da persolfato di ammonio 11. N-isopropilacrilammide (NIPAM), co-monomeri di acido acrilico (AAC) e allilamina (AA) e cross-linker N, N'-Methylenebisacrylamide (BIS) sono autorizzati a reagire a 70 ° C per 6 ore in condizioni diluite 11, 13. L'affinità di legame ad alta percentuale proteica di poli (N isopropilacrilammide-co-acrilico-acido) (poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis raggiunto da covalentemente incorporando coloranti-aminoacidi contenenti (es., Coloranti sulfonatedanthraquinonetriazine) nelle nanoparticelle attraverso una reazione ammidazione eseguita in solventi acquosi o organici a seconda delle caratteristiche idrofiliche / idrofobiche dei coloranti 11, 13. sostituzione nucleofila dei gruppi amminici della nanoparticella con l'atomo di cloruro di un colorante anthraquinonetriazine è utilizzata per creare-colorante contenente poli (NIPAM -CO-allilamina) (AA) nanoparticelle 11, 12. Un processo di polimerizzazione in due fasi viene utilizzato per creare nanoparticelle idrogel che contengono un guscio esterno di acido vinylsulfonic (VSA) 11, 13.
Nanoparticelle idrogel possono essere applicati a vari fluidi biologici, compreso il sangue intero, plasma, siero, liquido cerebrospinale, il sudore e l'urina. In un passo, in soluzione, il nanoparticles eseguire una rapida (entro pochi minuti) il sequestro e la concentrazione di basso peso molecolare analiti 10, 11, 13, 15-18. Le proteine sono successivamente eluiti dalle nanoparticelle e rilevati mediante Western Blotting 19-21, spettrometria di 10, 11, 13, 15, 18, 22 di massa, 23, saggi immunologici / ELISA 10, 11, 15, 18, o fase inversa proteina microarray 16, 24 saggi. Le nanoparticelle funzionalizzate con esche chimiche, e presentando un nucleo o nucleo shell architettura, la cattura e concentrano le proteine in base alle proprietà fisico-chimiche esca / shell. Diversi coloranti incorporati nelle nanoparticelle saranno quindi catturare diversi sottoinsiemi di proteine con diversa efficacia basata sull'affinità colorante, il pH della soluzione, e la presenza / assenza di competere proteine ad alto abbondante 13. Inoltre, la quantità di nanoparticelle in rapporto al volume della soluzione influenzerà la resa di proteine dalle nanoparticelle. Questi aspetti diidrogel nanoparticelle raccolta sono dimostrata utilizzando tre diverse esche nanoparticelle per le proteine raccolta di campioni di plasma che contengono elevate quantità di proteine, e da campioni di urina che in genere non contengono grandi quantità di proteine. In questo protocollo dimostriamo la raccolta e concentrazione fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa) da campioni di plasma mediante poli (NIPAM-co-AAC), Poli (NIPAM / colorante) e nanoparticelle core-shell (Poly (NIPAM-co-VSA)) . Poli (NIPAM / colorante) nanoparticelle sono mostrati a concentrarsi Mycobacterium antigene specie che è stato aggiunto a campioni di urina umana, per imitare Mycobacterium tuberculosis individui infetti.
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Protocol
Plasma umano e nelle urine sono stati raccolti da donatori volontari sani, con il consenso informato scritto, seguendo George Mason University Institutional Review Board protocolli approvati. I donatori sono stati equamente distribuiti tra maschi caucasici e femmine di età compresa tra 25 e 42 campioni sono stati analizzati individualmente tra e non sono stati riuniti.
1 nanoparticelle Elaborazione di siero o plasma
Basso potenziale di biomarcatori abbondanti nel plasma vengono catturati, in soluzione, con nanoparticelle idrogel. Le particelle vengono aggiunti al plasma, incubato, separato per centrifugazione, lavato, e le proteine vengono eluite catturate. Le proteine eluite vengono essiccati in corrente di azoto a valle per il sequenziamento spettrometria di massa e l'identificazione.
- Diluire 500 ml di siero 1: 2 con 50 mM TrisHCl pH 7 (siero ml 500 + 500 microlitri TrisHCl) in una provetta.
- Aggiungere 500 ml di poli (NIPAM / AAC) nucleo nanoparticoli. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 microlitri tiocianato di sodio (25 mm) al pellet. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte.
- Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 ml di acqua MilliQ al pellet nanoparticella. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte.
- Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Preparare il tampone di eluizione fresco: Aggiungere 700 ml di acetonitrile idrossido di ammonio 300 microlitri in una provetta pulita. Attenzione: idrossido di ammonio è corrosivo. Usare con ventilazione adeguata. Nota: Il buffer di eluizione devono essere prepared immediatamente prima dell'uso. Non conservare il tampone di eluizione.
- Aggiungere 300 ml di tampone di eluizione al pellet nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e conservare l'eluato in una, provetta etichettata e pulita.
- Ripetere i passaggi 1,9-1,10. Unire i due eluati in una provetta.
- Essiccare gli eluati sotto flusso di azoto in un collettore evaporatore azoto a 42,1 ° C, con flusso d'aria impostata a 8 (Figura 2F).
- Conservare l'eluato essiccata a temperatura ambiente per O / N stoccaggio, oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine, prima della spettrometria di massa, western blotting, o test ELISA (opzionale).
2. nanoparticelle Trattamento dei Campioni di urina
L'urina normale contiene meno di 30 mg / dl e proteinemeno di 1+ sangue. Tuttavia, molte malattie / condizioni possono alterare i normali livelli di proteine nelle urine e del sangue. Per aiutare a determinare il volume ottimale di nanoparticelle da aggiungere al campione di urine, un esame delle urine viene eseguito prima di nanoparticelle di raccolta. Possono esistere biomarcatori urine in concentrazioni estremamente basse, che possono richiedere l'ottimizzazione del rapporto tra nanoparticelle di volume urinario. Questa procedura descrive nanoparticelle raccolta di campioni di urine per la valle analisi western blot.
- Raccogliere campioni di urina in un bicchiere di plastica pulito, asciutto. È richiesto un volume minimo di 22 ml. Urine Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento di analizzare.
- Scongelare l'urina congelata a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. Mescolare brevemente su vortex. Versare almeno 22 ml di urina in una provetta di polipropilene fondo conico da 50 ml.
- Spin urine in una centrifuga con rotore swing-out a 3.700 xg per 15 min. Decantare l'urina, senza disturbare il pellet, in un ambiente pulito polypr fondo conico da 50 mltubo opylene. Eliminare il pellet.
- Eseguire l'analisi delle urine con un multi-analita "urine con stick reattivo" striscia reagente. Nota: conservare le strisce reagenti in un contenitore ermeticamente chiuso lontano dalla luce diretta del sole e dall'umidità 17, 18.
- Posare la striscia reagente, a faccia in su, su un fazzoletto di carta pulito e asciutto.
- Utilizzare una pipetta monouso per aspirare 1 ml di urina preparato al punto 2.3.
- Impostare un timer per 2 min, ma non avviarlo. Erogare rapidamente 1 - 2 gocce di urina su ogni pad prova della striscia reagente. Avviare immediatamente il timer. Nota: Non immergere la striscia reagente direttamente nel contenitore urine. Gli indicatori colorante / chimici nella striscia reagente possono potenzialmente percolare fuori della striscia reagente nel contenitore urine.
- Al tempo indicato sul flacone delle strisce di reagente, registrare i risultati qualitativi per i vari analiti sulla striscia reagente confrontando il colore delle singole strisce reagenti alla corrispondente indica codice coloretori sul contenitore del reagente. Tipici normali risultati delle urine sono: (normale o negativo) per il sangue, proteine, leucociti, nitriti, glucosio, chetoni, bilirubina e urobilinogeno; Urine pH (5,5-7,0); peso specifico (1,001-1,020). Nota: Alti livelli di proteine in un campione di urina possono competere con la proteina di interesse per i siti sulle nanoparticelle vincolanti. Per massimizzare la raccolta di proteine con nanoparticelle, l'/ volume di urina volume di nanoparticelle può essere regolato sia per limitare la concorrenza da proteine di alta abbondanza, o può essere ottimizzato per raccogliere le proteine presenti in concentrazioni molto basse. Se il valore di proteine nelle urine è 1+ o superiore, aggiungere 2x volumi di nanoparticelle nella fase 2.5. Se l'analita di interesse è molto basso abbondante proteina, può essere necessario aumentare il volume delle nanoparticelle fino a 2 ml (Figura 3).
- Trasferire 20 ml di urina chiarito dal punto 2.3 in una provetta da 50 ml pulito polipropilene fondo conico. Nondisturbare eventuali detriti / pellet che possono essere nel fondo della provetta urina. Aggiungere 200 ml di nanoparticelle per il campione di urina 20 ml. Mescolare brevemente su vortex. Nota: Se il valore di proteine nelle urine è 1+ o superiore, aggiungere 400 ml di nanoparticelle a 20 ml di urina.
- Incubare la miscela urine / nanoparticelle per 30 minuti a temperatura ambiente, senza che a dondolo / miscelazione.
- Centrifugare la sospensione urina / nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore oscillante a 3.700 xg per 10 min. Nota: se un pellet non è visibile Dopo la centrifugazione, girare i campioni per un ulteriore 2 - 7 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere acqua 500 microlitri MilliQ al pellet nanoparticelle.
- Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Trasferire la soluzione di nanoparticelle di un ambiente pulito 1,5 ml provetta.
- Spin le nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso a 16.100 xg per 10 min. Nota: se un pellet non è fol visibileguendo centrifugazione, girare i campioni per un ulteriore 2-7 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante.
- Ripetere i punti 2.8 e 2.11 (due volte) con 200 ml 18 MilliQ acqua per lavare le nanoparticelle.
- Preparare il tampone di eluizione fresco: Aggiungere 970 ml di acetonitrile idrossido di ammonio 30 ml in una provetta pulita. Attenzione: idrossido di ammonio è corrosivo. Usare con ventilazione adeguata. Nota: Il buffer di eluizione deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. Non conservare il tampone di eluizione.
- Aggiungere 20 microlitri tampone di eluizione al pellet nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Spin i campioni di nanoparticelle a 16.100 xg per 10 min. Rimuovere e conservare il surnatante in una provetta pulita da microcentrifuga da 1,5 ml. Non disturbare il pellet nanoparticelle. Eliminare il pellet nel rischio biologico spazzatura.
- Mettere i campioni in un rack in una cappa. Aprire i tappi e incUbate a temperatura ambiente per 30 min. In alternativa, posizionare i campioni sotto flusso di azoto a 40 ° C fino a secco (1 - 2 ore).
- Aggiungere 15 microlitri tampone Tris-glicina SDS (2x) per i campioni. Riscaldare a 100 ° C in un blocco a calore secco per 5 min con i tappi aperti o fino a quando il volume lasciato nel tubo non è più di 20 microlitri. Nota: non utilizzare un bagno di acqua bollente. L'umidità dal bagno di acqua impedirà l'evaporazione del buffer.
- Posizionare il tappo sui tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di calore. Il campione può essere conservato a -80 ° C o utilizzato immediatamente a valle per l'analisi western blot.
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Representative Results
Hydrogel nanoparticelle Dimensioni e uniformità
Poli (NIPAM-AAC) le particelle sono state prodotte con altissima resa e riproducibilità tra e all'interno di lotti. Le particelle hanno una buona stabilità colloidale a RT per il tempo necessario per l'acquisizione, la memorizzazione e l'eluizione delle proteine (almeno 48 ore), e nanoparticelle precipitazione non è stato osservato (Figura 1) 11. La stabilità colloidale può essere molto importante per una rapida proteina / peptide assorbimento da nanoparticelle.
I potenziali biomarcatori Low-abbondanza raccolte da plasma
L'incorporazione del colorante esca spinge l'assorbimento delle molecole in soluzione e assicura che le molecole catturate sono conservati dal degrado 13, 15, 18, 25. Per questo motivo, gli inibitori della proteasi non sono necessari durante campione di pre-elaborazione. Questo attributo delle nanoparticelle li rende sdatto come una tecnologia di conservazione per la raccolta del campione sul campo e per la spedizione di fluidi biologici durante il RT.
La molecola esca può essere incorporato nella particella idrogel per copolimerizzazione o legame covalente di gruppi funzionali presenti nella nanoparticelle. A titolo di esempio, poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticelle sono stati costruiti con aminoacidi contenenti coloranti tramite reazioni di reticolazione amidazione lunghezza zero, mentre le nanoparticelle di cui l'esterno contenente vinylsulfonic acido (VSA) copolimero sono stati creati da una seconda reazione di polimerizzazione 10-13. Diversi tipi di nanoparticelle possono essere prodotte da incorporando un diverso colorante chimico all'interno della nanoparticella e migliorare di conseguenza la raccolta di specifiche classi di proteine. Un concetto importante della nostra tecnologia è che diverse esche possono mostrano una affinità preferenziale per le proteine differenti, perché l'interazione proteina-colorante dipende principalmente una combinazione di interazioni idrofobiche, 3-D Interaczioni, e le forze elettrostatiche. Abbiamo osservato che alcuni analiti possono essere catturate con alta affinità chimica da diversi coloranti a causa della complessità delle forze di legame. Per una vasta spiegazione ed esempi di questo principio 13 Vedi Tamburro et al.. Ad esempio, quattro diversi tipi di cattura esche (nanoparticelle) sono stati usati per raccogliere TNFa dal plasma con 200 ml di particelle e 200 ml di plasma per ogni tipo di nanoparticelle. In tutti i casi dopo il trattamento con le nanoparticelle, TNFa non era rilevabile nel surnatante mediante SDS-PAGE con colorazione argento, mentre TNFa era rilevabile nell'eluato nanoparticelle (Figura 1C). (Lane 1 = TNF ricombinante (MW 17.000 Da), Lanes 2 & 3, 4 e 5, 6 e 7 e 8 e 9 rappresentano i risultati per quattro differenti tipi di esche nanoparticelle rispettivamente C = controllo, S = surnatante, P = nanoparticelle eluato).
Dose-risposta per Diffeaffitto Tipi di N anoparticles
Al fine di eseguire una curva di calibrazione, e quindi valutare il rendimento e precisione, gli esperimenti devono essere eseguite con le proteine spillo-in di concentrazione nota. Risultati pubblicati per una varietà di fluidi corporei e analiti dimostrano come le nanoparticelle di pre-processing mantiene linearità del dosaggio e stabilisce una curva di calibrazione, migliorando il limite effettivo di rilevazione 10, 16, 26. Abbiamo anche pubblicato studi di precisione inter-laboratorio utilizzando le nanoparticelle per condurre multi-reazione di monitoraggio spettrometria di massa con una maggiore sensibilità 27.
Per confrontare IL-17 efficienza di raccolta da diversi tipi di nanoparticelle, è stato aggiunto ricombinante IL-17 (17,5 kDa) per campioni di plasma in cui sia poli (NIPAM-co-AAC) o poli (NIPAM-co-VSA) nanoparticelle sono state successivamente aggiunte . Due set di quattro diluizioni seriali di 100 ng di ricombinante IL-17 sono stati preparati in 10081, l plasma (100 ng / 100 ml, 50 ng / 100 ml, 25 ng / 100 ml e 12,5 ng / 100 ml). poli (NIPAM-co-AAC) o poli (NIPAM-co-VSA) particelle furono aggiunti ai rispettivi campioni di plasma in un 1: (v / v) particella 1: rapporto plasma. Un test spettrofotometrico di proteine totali è stata effettuata sui campioni surnatante. Western blotting con anticorpi policlonali di coniglio anti-IL-17 è stato eseguito su 20 mg di plasma supernatante (S) dopo la raccolta delle nanoparticelle e gli eluati nanoparticelle (P) (Figura 4). Entrambi i tipi di nanoparticelle opportunamente raccolte e concentrate IL-17 ad ogni diluizione. Le bande aggiuntive sul Western Blot rappresentano albumina sierica umana e immunoglobuline che cross-reagiscono con l'anticorpo secondario. (particelle AAC: corsie 1 e 2 = 1 ng / ml di IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / ml, Lanes 5 e 6 = 0.25 ng / mL, Lanes 7 e 8 = 0,125 ng / ml, corsia 9 = IL-17; VSA particelle: Lanes 1 & 2 = 1 ng / mL di IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / ml,Lanes 5 e 6 = 0.25 ng / ml, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / mL).
Rilevamento di proteine potenzialmente diagnostici in urine
Campioni di urina umana, ottenuti da donatori volontari sani con il consenso informato scritto, sono stati diluiti con una specie di Mycobacterium antigene ricombinante proteina secretoria precoce target Mycobacterium Tuberculosis (ESAT-6) per imitare Mycobacterium tuberculosis individui infetti. 1 mg ciascuno di ESAT-6 (15 kDa) e IL-2 (15,5 kDa) sono stati aggiunti 1 ml aliquote di urina umana raccolti da donatori volontari sani. L'analisi delle urine è stata effettuata su campioni con una striscia reagente urine per determinare il rapporto ottimale di nanoparticelle di urina, che si è basata sulla presenza / assenza di proteine urinarie. Poli (NIPAM / colorante) nanoparticelle sono stati usati per raccogliere proteine da campioni di urina trattati e non trattati. Elettroforesi su gel monodimensionale degli eluati nanoparticelle è stata eseguita fsusseguono da colorazione argento. I campioni in U4 e U6 corsie rappresentano eluati nanoparticelle da ESAT-6 e IL-2 campioni di urina trattati, mostrando chiaramente le bande di spicco a 15 kDa (Figura 5). La spettrometria di massa degli eluati identificati ESAT-6 (UniProt POA567 adesione, 84,0 copertura, 9 peptidi) e IL-2 (UniProt P60568 adesione, 38.56 di copertura, 3 peptidi). Urine senza nanoparticelle raccolta è mostrato nella corsia etichetta "Raw".
Figura 1. Nanoparticelle raccolto e concentrato proteine poco abbondanti da fluidi biologici complessi. (A) Flusso di lavoro per le proteine di raccolta. Tempo di elaborazione totale è di circa 1,5 ore. Le proteine in soluzione sono concentrate da sangue, siero, plasma, urine, sudore, saliva o altri fluidi corporei (concentrazione 1.000 volte raffigurato). (B)Batch di confronto in batch che mostra la dimensione uniforme delle nanoparticelle. Microscopia a forza atomica su mica mostra uniformità di dimensioni (0,7 micron di diametro) e l'assenza di aggregazione in due lotti di nanoparticelle. (C) 1-D elettroforesi su gel, con successiva colorazione argento, del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF) sequestrata dal plasma. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 nanoparticelle procedura di raccolta da plasma / siero per l'analisi di spettrometria di massa a valle. (A) Le nanoparticelle rimangono sospese in soluzione (Poly (NIPAM / colorante) mostrato). (B) Le nanoparticelle vengono aggiunti al campione di plasma diluito. (C) L' nanoparticelle-plasma sospensione is filata in una centrifuga per separare le nanoparticelle dal supernatante. (D) post centrifugazione, le nanoparticelle formare un pellet distinta nel fondo della provetta. (E) Dopo aver lavato le nanoparticelle, l'eluato contenente le proteine raccolti viene rimosso e salvato . per l'analisi a valle (F) L'eluato è essiccato sotto flusso di azoto in un evaporatore a 42.1 ° C, il flusso d'aria 8, per 1 -. 2 ore prima della spettrometria di massa Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi delle urine con strisce reagenti multi-analita per il controllo qualità dei campioni. (A) Ogni pad sulla striscia reagente è impregnato di coloranti chimici, enzimi, e / o indicatori che reagiscono con un diversoent urine analita (ad es., glucosio, bilirubina, chetone, peso specifico, sangue, pH, proteine, urobilinogeno, nitriti, e / o esterasi leucocitaria). L'urina viene chiarito dalla centrifugazione. Una goccia di urina viene aggiunto a ciascun pad sulla striscia reagente. (B) Il colore di ciascun pad viene confrontato visivamente i blocchi di colore sul contenitore, al momento specificato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. La raccolta di IL-17 da plasma usando nucleo (AAC) o core-shell (VSA) nanoparticelle. Elettroforesi su gel 1-D e Western blotting con anticorpi anti-IL-17 dimostra la capacità di acido acrilico (AAC) e VSA nanoparticelle core shell per raccogliere varie concentrations di IL-17 da plasma. (S = surnatante dopo la raccolta delle nanoparticelle, particelle P = nanoparticelle eluato AAC:. Corsie 1 e 2 = 1 ng / ml di IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / ml, Lanes 5 & 6 = 0.25ng / ml, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ml, corsia 9 = IL-17; particelle VSA: Lanes 1 & 2 = 1 ng / ml di IL-17, Lanes 3 & 4 = 0.50 ng / ml, Lanes 5 & 6 = 0.25 ng / microlitri, Lanes 7 & 8 = 0,125 ng / ml) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Recupero di Mycobacterium tuberculosis antigeni e citochine IL-2 da urine utilizzando nanoparticelle idrogel. Colorazione argento seguente 1-D gel elettroforesi dei campioni di urina. I campioni in corsie U4 e U6 rappresentano eluati da campioni di urina contenenti ricombinante ESAT-6 e IL-2, che mostra chiaramente le bande di spicco a 15 kDa. La spettrometria di massa degli eluati identificati ESAT-6 (UniProt POA567 adesione, 84,0 copertura, 9 peptidi) e IL-2 (UniProt P60568 adesione, 38.56 di copertura, 3 peptidi). (RAW = urina senza nanoparticelle raccolta; U1, U2, U3, U5, U7, U8 = urina priva ricombinante ESAT-6 e IL-2 dopo la raccolta di nanoparticelle). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Nome Protein | GI numero di proteine | Concentrazione nel siero / plasma [ng / ml] | Riferimento |
| abl-interattore 1 isoforma un | 61743942 | Sconosciuto | |
| AMP-activated protein chinasi gamma2 subunità isoforma un | 33186925 | Sconosciuto | |
| Cas-Br-M (murino) ecotropic retrovirale trasformazione sequenza | 52426745 | Sconosciuto | |
| chemochina (motif CC) legante 18 (polmonare e l'attivazione regolamentato) | 4506831 | 30 | 34 |
| chemochina (Motif CC) ligando 5 | 22538814 | 1.5 | 31 |
| chondroadherin | 153251229 | Sconosciuto | |
| cromosoma 16 lettura aperta telaio 80 | 8392875 | Sconosciuto | |
| Consortin | 213021160 | Sconosciuto | |
| defensin, alfa 4, corticostatin | 4503303 | Sconosciuto | |
| 20149675 | Sconosciuto | ||
| glicoproteina Ib (piastrine), beta polipeptide | 4504073 | Sconosciuto | |
| guanina nucleotide binding protein (proteine G), q polipeptide | 40254462 | Sconosciuto | |
| Dell'eparanasi | 148746204 | Sconosciuto | |
| fattore di crescita insulino-simile 2 (somatomedina A) | 189083846 | 115px; "> 10030 | |
| lacritin | 15187164 | Sconosciuto | |
| leucociti cellule derivate chemotaxin 2 | 59806345 | 200.000 | 33 |
| lipocalina 2 (24p3 oncogene) | 38455402 | 0.05 | 28 |
| Monoglyceride lipasi, CRA_b isoforma | 6005786 | Sconosciuto | |
| N-etilmaleimmide sensibile proteina fattore di attaccamento, Alphun | 47933379 | Sconosciuto | |
| un taglio homeobox 2 | 119220564 | Sconosciuto | |
| esterno in fibra densa di code di sperma 4 | 171184433 | Sconosciuto | |
| palato, polmoni e nasale epitelio associato | 18765705 | Sconosciuto | |
| riconoscimento proteina peptidoglicano 2 | 156616294 | Sconosciuto | |
| 77695917 | 4 | 29 | |
| Proteine CASC3 | 15721939 | Sconosciuto | |
| RAB27B, RAS membro oncogene famiglia | 5729997 | Sconosciuto | |
| Associazione Ras (RalGDS / AF-6) famiglia dominio 6 isoforma un | 29789443 | Sconosciuto | |
| ras-correlate GTP-binding protein RAB10 | 33695095 Sconosciuto | ||
| anello di barretta proteica 166 | 30520320 | Sconosciuto | |
| Risposta deprivazione di siero (fosfatidilserina binding protein) | 4759082 | Sconosciuto | |
| solute carrier famiglia 33 (acetil-CoA trasportatore), membro 1 | 4757708 | Sconosciuto | |
| ST6 beta-galactosamide alfa-2,6-sialyltranferase 1 isoforma un | 27765091 | 15 | 32 |
| timosina-like 3 | 34013530 | Sconosciuto | |
| transducina-come enhancer di divisione 3 (E (SP135) omologo, Drosophila) | 157384982 | Sconosciuto | |
| transglutaminasi 1 | 4507475 | Sconosciuto | |
| WD dominio ripetere 1 | 9257257 | Sconosciuto | |
| WD dominio ripetere 91 | 222080092 | px; "> Unknown||
| ripetere contenente 2 xin actina vincolante | 119372317 | Sconosciuto |
Tabella 1 Esempi di proteine a bassa abbondanza raccolte da nanoparticelle di siero / plasma. (PeptideAtlas peptidoma spettrometria di massa) 28-34 Adattato con riferimento permissionfrom 13 (Tamburro, D. et al Multi-funzionale nanoparticelle core-shell:... Scoperta dei biomarcatori precedentemente invisibili J Am Chem Soc, 133, 19.178-19.188, (2011 ).) Copyright 2011 American Chemical Society.
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Discussion
Rilevanza clinica
Un campione di siero o plasma è pensato per contenere bassa abbondanza di proteine e peptidi in grado di fornire una ricca fonte di informazioni per quanto riguarda lo stato dell'organismo nel suo complesso circolante. Nonostante la promessa di proteomica del siero, ci sono tre barriere fisiologiche fondamentali e gravi contrastare scoperta di biomarcatori e la traduzione di beneficio clinico 10, 11, 16, 25.
Possono esistere 1. importanti biomarcatori diagnostici estremamente basso-abbondanza (concentrazione) nel sangue. All'inizio fase tessuto malato, come ad esempio le lesioni pre-tumorali metastatiche, può costituire meno di un paio di mm 3. Biomarcatori capannone in circolo da un tale piccolo volume di tessuto diventerà molto diluita in tutto il volume del sangue. Possono esistere analiti rilevanti al di sotto dei limiti di rilevazione di spettrometria di massa e di saggi immunologici convenzionali.
2. biomarcatori abbondanza Low /proteine sono mascherati dalla presenza di elevati abbondanti proteine come albumina e immunoglobuline, che rappresentano il 90% del proteoma del plasma 14.
3. proteine e peptidi sono suscettibili alla degradazione da proteasi endogene ed esogene seguente venipuntura e il campione del trasporto / stoccaggio. Degradazione delle proteine può portare a risultati falsi positivi o falsi negativi 35.
Nanoparticelle idrogel sono stati sviluppati come porose, capaci di galleggiare, polimeri contenenti coloranti anthraquinonetriazine e / o conchiglie di acido vinylsulfonic di proteine e peptidi raccolta e la conservazione di liquidi organici 11, 13. Nostro gruppo sintetizzati e testati nanoparticelle funzionalizzate idrogel con una pletora di coloranti organici (ad esempio. , solfonati e coloranti non sulfonatedanthraquinonetriazine) e hanno mostrato le affinità preferenziale per diversi proteina analiti 11, 13. Abbiamo anche stabilito protocolli per la scoperta di biomarcatori che utilizzanonanoparticelle idrogel con linfa, saliva, liquido cerebrospinale, il sudore, l'urina, plasma, sangue, o di siero 11, 13, 23, 24, 26.
Ottimizzazione dei parametri di nanoparticelle di raccolta prima della raccolta proteine da campioni clinici / ricerca preziosi è necessario per ottenere risultati ottimali. La quantità di proteine nei campioni dovrebbe essere quantificato per determinare il rapporto ottimale di nanoparticelle di volume del campione. Per analiti di concentrazione sconosciuta, una curva dose-risposta utilizzando proteine ricombinanti fornisce informazioni per quanto riguarda i limiti di rilevamento. Se vi è sufficiente campione, vari tipi di nanoparticelle possono essere usate per determinare la nanoparticella ideale per l'analita e campione.
Analisi delle urine prima di nanoparticelle raccolta fornisce un controllo di controllo di qualità del campione di urina. L'affinità dell'esca nanoparticelle colorante dipende dal punto isoelettrico della proteina di interesse e il pH del mezzo circostante. Urine pH siatween 5.5 e 7.0 è ottimale per la raccolta proteina con i poli (NIPAM / dye) nanoparticelle. La presenza di globuli rossi emolizzati o intatti (1+ sangue sulla striscia reagente) non interferisce con nanoparticelle di raccolta.
In questo protocollo ci siamo concentrati sull'applicazione delle nanoparticelle idrogel per raccogliere le proteine dal plasma e nelle urine. Le applicazioni future potrebbero comprendere altri fluidi corporei come vitreo dell'occhio, o liquido sinoviale. Potenziale in applicazioni in vivo può essere immaginato per il futuro in cui le nanoparticelle vengono iniettati nel tessuto malato per raccogliere biomolecole. Il lavoro futuro sarà inoltre focalizzata sullo sviluppo di nuovi dispositivi per la cattura e la conservazione dei biomarcatori, come ad esempio un cerotto a base di nanoparticelle, per l'analisi del proteoma trasudato pelle.
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Acknowledgments
Michael Henry, Dublin City University, gentilmente aiutato con la raccolta e analisi dei dati illustrato in Figura 5. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da (1) George Mason University, (2) l'italiano IstitutoSuperiore di Sanita 'nel quadro della Italia / USA accordo di cooperazione tra il Dipartimento di Salute e Servizi Umani, George Mason University, e il Ministero della Salute pubblica italiana, (3) NIH, borse di programma IMAT 1R21CA137706-01 e 1R33CA173359-01 a LAL, e (4) Ceres Nanoscienze, Inc .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50 mM pH 7.0 | VWR | IC816116 | 50 mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | Available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | Available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| Sodium thiocyanate 25 mM | Acros Organics | 419675000 | For serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | For urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | Use at RT to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | Do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | For serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50 ml tube capacity, rcf 3,700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7 ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | With screw caps for urine samples |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | Seconds/minutes |
References
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