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Neuroscience

बोटुलिनम Neurotoxin inhibitors के पहचान के लिए एक उच्च सामग्री इमेजिंग परख

Published: November 14, 2014 doi: 10.3791/51915
Automatic Translation
1,6, 2,6,7, 3,6, 4,6, 3,5,6, 6, 2,6,7, 6
1Perkin Elmer Inc., 2Henry M. Jackson Foundation, 3The Geneva Foundation, 4ORISE, 5Frederick National Laboratory for Cancer Research, 6Division of Molecular and Translational Sciences, US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 7DoD Biotechnology High Performance Computing Software Applications Institute (BHSAI), Telemedicine and Advanced Technology Research Center (TATRC), US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC)

Introduction

जीवाणु क्लोस्ट्रीडियम बोटुलिनम बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन, 1 आदमी के लिए जाना जाता है सबसे शक्तिशाली जैविक विषाक्त पदार्थों में से एक पैदा करता है. 7 अलग BoNT सीरमप्रकारों (BoNT / एजी) कर रहे हैं. BoNT / ए-पित्त के कारण जाल जटिल प्रोटियोलिसिस 2,3 करने neuromuscular जंक्शन पर पक्षाघात प्रेरित. जाल प्रोटियोलिसिस न्यूरोट्रांसमीटर पुटिका-झिल्ली संलयन से बचाता है और इसलिए ब्लॉक एक्सोसाइटोसिस 4 neurotransmitter. विशिष्ट जाल लक्ष्य नशा प्रक्रिया में शामिल विशेष BoNT सीरोटाइप पर निर्भर करता है. BoNT / ए और BoNT / ई फोड़ना तस्वीर 25 BoNT / सी cleaves दोनों तस्वीर 25 और syntaxin 5 जबकि. भी पुटिका जुड़े झिल्ली प्रोटीन (खलनायिका) नामक शेष सीरमप्रकारों फोड़ना synaptobrevin (. BoNT / ए यह प्राकृतिक रूप से उत्पन्न बोटुलिज़्म की एक उच्च अनुपात के लिए जिम्मेदार है के रूप में परख विकास के लिए चुना है और छोटे अणु की कार्रवाई 6. विकास की सबसे लंबी अवधि है किया गया था BoNT / ए के खिलाफ चिकित्सा विज्ञान के लिए एक प्रमुख लक्ष्य हैहमारे दवाओं की खोज कार्यक्रम और, 8-10 सक्रिय साइट प्रोटियोलिटिक अवरोधकों 7 की पहचान करने के लिए परंपरागत लक्ष्य आधारित विधियों का उपयोग किया गया है. हालांकि, कई सीरमप्रकारों और बाद जोखिम प्रभावकारिता के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम गतिविधि के साथ सक्रिय साइट अवरोधकों के निर्माण की संभावना चुनौतीपूर्ण होगा.

इसलिए हम BoNT की मध्यस्थता मोटर न्यूरॉन नशा ब्लॉक कर सकते हैं कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए एक कार्यात्मक समापन बिंदु के रूप में BoNT तस्वीर 25 दरार का उपयोग करता है कि एक अभिनव, प्ररूपी दवाओं की खोज दृष्टिकोण को लागू किया है. तस्वीर 25 विवो में पक्षाघात और मारक का भविष्य कहनेवाला है तस्वीर 25 की गिरावट के रूप में, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, सेल आधारित स्क्रीनिंग विष निष्क्रियता या लक्षित कोशिकाओं के अंदर विष रास्ते के निषेध के लिए जिम्मेदार सेलुलर कारकों की नई modulators की खोज करने के लिए ले जा सकता है. प्ररूपी परख विकास में एक महत्वपूर्ण कारक physiologically प्रासंगिक जैविक मॉडल का चयन है. डब्ल्यूई और दूसरों तस्वीर 25 11- 13 की अभिव्यक्ति सहित प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स की immunologic चरित्र पुनरावृत्ति कि माउस भ्रूणीय स्टेम (ते) सेल व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स, का वर्णन किया है. महत्वपूर्ण बात है, इन सेलुलर सिस्टम BoNT / ए नशा करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं और विष 11,12 की सांद्रता में वृद्धि के जवाब में तस्वीर-25 की खुराक पर निर्भर दरार प्रदर्शित करता है. भेदभाव मोटर न्यूरॉन्स भी उच्च throughput प्लेट आधारित विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं और सेलुलर assays के एक सरणी के डिजाइन की अनुमति दी है कि मात्रा में उत्पादन कर रहे हैं.

प्ररूपी परख BoNT / माउस मोटर न्यूरॉन संस्कृति की एक नशा दौरान endogenously व्यक्त पूरी लंबाई की तस्वीर-25 की दरार यों दो अलग एंटीबॉडी का उपयोग एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि है. केवल पूर्ण लंबाई तस्वीर 25 पहचानता है कि एक carboxyl टर्मिनल BoNT / एक दरार के प्रति संवेदनशील (BACS) एंटीबॉडी तस्वीर 25 की BoNT / ए मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस के मूल्यांकन की अनुमति देता हैमाउस मोटर में अभिव्यक्ति 10 न्यूरॉन्स. एचसीआई परख का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है.

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Protocol

प्लेट 20,000 भेदभाव माउस ES कोशिकाओं (एमईएस) / अच्छी तरह से एक साथ 96 पाली-डी लाइसिन लेपित प्लेटें में और 5-7 दिनों के लिए मोटर न्यूरॉन टर्मिनल भेदभाव मीडिया में बनाए रखना.

BoNT / ए के साथ 1. यौगिक प्रशासन और नशा

सीडीसी / एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुपालन बनाए रखने के लिए एक BSL2 बाड़े में निम्नलिखित कार्य के सभी प्रदर्शन.

  1. Polypropylene के 96 अच्छी तरह प्लेटें में 100% DMSO में प्रत्येक पुस्तकालय परिसर के 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार करें. वांछित स्क्रीनिंग एकाग्रता से अधिक से अधिक 10 गुना है कि एक मध्यवर्ती कमजोर पड़ने की थाली तैयार करने के लिए 10 मिमी स्टॉक का उपयोग करें. 96 अच्छी तरह से थाली में 10 मिमी स्टॉक वितरण से 100 उम मध्यवर्ती थाली तैयार है और संस्कृति मीडिया का उपयोग कर 100 उम के लिए यह पतला. कोशिकाओं 11 पर मीडिया के 90 μl पर यौगिकों के 10 μl बग़ैर. 10 उम अंतिम एकाग्रता में यौगिकों टेस्ट और 0.5% से अधिक नहीं है DMSO के अंतिम प्रतिशत सुनिश्चित करते हैं.
  2. सभी संवर्धन प्रदर्शनजैव सुरक्षा स्तर 2 परिस्थितियों में जीवित कोशिकाओं और सक्रिय विष का उपयोग कि एँ. ताजा टर्मिनल भेदभाव मीडिया के 80 μl एक 12 चैनल का मार्गदर्शन पिपेट का उपयोग के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें में पुराने मीडिया बदलें. आकांक्षा से बाहर ले जाने और परिवेशी वायु को मीडिया के बिना कोशिकाओं के जोखिम से बचने के लिए पंक्तियों से कदम बांटना.
  3. (दो बार) पूर्व आकांक्षा से मिश्रण के बाद 12 चैनल पिपेट, का उपयोग स्रोत थाली से 10x यौगिकों के 10 μl के अलावा द्वारा विष का आवेदन करने के यौगिकों के साथ कोशिकाओं pretreat. प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए, के रूप में उच्च संकेत और कम संकेत नियंत्रण की सेवा के लिए मीडिया में पतला 10x DMSO के साथ 6 कुओं के दो स्तंभों का इलाज. BoNT इलाज के बिना स्तंभ पूरी लंबाई की तस्वीर-25 (उच्च संकेत नियंत्रण) के उच्चतम स्तर को दर्शाती है. कम संकेत नियंत्रण के रूप में (किसी भी यौगिकों के बिना) अकेले BoNT साथ अन्य स्तंभ समझो. (BACS एंटीबॉडी के साथ तस्वीर-25 और अपनी पहचान की BoNT दरार की दक्षता का निरीक्षण करने के चित्रा 2 कम नियंत्रण का प्रयोग करें).
  4. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 6% सीओ 2 के लिए यौगिकों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  5. फास्फेट में एक 1 मिलीग्राम / एमएल वाणिज्यिक स्रोत से बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन एक तैयार टर्मिनल भेदभाव मीडिया के साथ गिराए द्वारा एक अंतिम 10x काम कर स्टॉक करने के लिए खारा (पीबीएस) buffered.
  6. एक multichannel विंदुक (चित्रा 2) का उपयोग उपचार और कम संकेत नियंत्रण के लिए नामित कुओं में 10x BoNT / एक शेयर की 10 μl जोड़कर नशा आरंभ. अकेले मीडिया के साथ उच्च नियंत्रण के रूप में नामित कुओं समझो.
  7. कम से कम 20 मिनट के लिए पानी में 0.825% हाइपोक्लोराइट समाधान में विसर्जन के द्वारा अध्ययन के दौरान BoNT / ए के साथ संपर्क में आता है कि सभी प्लास्टिक के बर्तन और अन्य disposables शुद्ध करना. जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन और पहले और ऐसे Microchem समाधान के रूप में 5% डिटर्जेंट कीटाणुनाशक क्लीनर के साथ प्रयोगों के बाद दोनों कार्य क्षेत्र शुद्ध करना.
  8. विष का उपयोग करें और incub निरूपित करने के लिए स्पष्ट रूप से प्लेटें लेबलखाया प्लेटें एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटा और 6% सीओ 2 के लिए 1 एनएम / एल BoNT / ए के साथ इलाज किया. विष प्रयोगशाला में प्रयोग में है कि सहयोगियों को सूचित करने के लिए उपयुक्त signage प्रदर्शन.
  9. बंद करो BONT / मेथनॉल निर्धारण द्वारा एक प्रोटियोलिटिक दरार. एक multichannel विंदुक के साथ एक अच्छी तरह से विष और यौगिकों से युक्त मीडिया निकालें और 10% ब्लीच समाधान में त्यागें. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सीधे बर्फ ठंड मेथनॉल (100 μl) जोड़ें.
  10. निर्धारण होने के लिये अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर 15 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं.
  11. निर्धारण के बाद सुरक्षित रूप से जैव सुरक्षा स्तर 1 प्रोटोकॉल के साथ खारिज कर दिया अभिकर्मकों (निष्प्रभावी माना जाता है) को संभालने और तदनुसार त्यागें.
  12. मेथनॉल त्यागें और कोशिकाओं को धोने और immunostaining से पहले उन्हें rehydrate पीबीएस के 100 μl का उपयोग करें. दो अतिरिक्त पीबीएस washes प्रदर्शन करना.
  13. अंतिम धोने के बाद, विश्लेषण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर microplate चिपकने वाली फिल्म और दुकान के साथ कुओं, मुहर प्लेटों में पीबीएस छोड़ दें. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कम से स्टोर प्लेटेंकई दिनों आर.

2. Immunostaining

immunostaining प्रक्रिया महत्वपूर्ण intraplate और interplate परिवर्तनशीलता के संभावित शुरुआत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो दोहराए अभिकर्मक बांटना / महाप्राण चक्र और व्यापक प्लेट धोने शामिल है कि एक श्रम प्रधान, multistep ऑपरेशन है. एक अर्द्ध स्वचालित दृष्टिकोण, प्रयोगशाला कर्मियों का समय बचाने परख throughput बढ़ाने, और परिवर्तनशीलता immunostaining कम करने के लिए लागू किया जाता है.

  1. इस प्रोटोकॉल के लिए मॉड्यूलर डेक पर विभिन्न स्थानों (सामग्री और उपकरण देखें) में Labware स्थानांतरित करने के लिए एक रोबोट ग्रिपर हाथ के साथ 250 μl करने और एकीकृत संस्करणों में परिवर्तित करने में सक्षम एक 96 अच्छी तरह सिर से लैस एक स्वचालित कार्य केंद्र का उपयोग करें.
    1. मॉड्यूलर डेक Labware के विभिन्न प्रकार की मेजबानी के लिए और किसी भी एक समय पर 11 आइटम के लिए समर्थन कर सकते हैं बनाया गया है. स्वचालित microplate हैंडलर पकड़ के क्रम में एक दोहरी पत्रिका microplate स्टेकर से सुसज्जित है औरचक्र के अनुसार 50 प्लेटों के लिए ऊपर हेरफेर.
    2. स्वचालित वर्कस्टेशन बाँझपन और सुरक्षा प्रदान करने के लिए प्रयोगशाला स्वचालन उपकरण के लिए बनाया गया एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर स्थित है. जरूरत के रूप में और मानव हस्तक्षेप के बिना अभिकर्मक पहुँच सक्षम करने के लिए 3 चित्र में दिखाया गया के रूप में स्वचालित immunostaining के लिए, डेक व्यवस्था की है.
  2. तरल से निपटने के संचालन के लिए जरूरत के रूप में डेक करने के लिए थाली पत्रिका और हस्तांतरण में तय की कोशिकाओं से युक्त प्री-लोड प्लेटें. नीचे 10 μl कुओं से पीबीएस महाप्राण के लिए 250 μl सुझावों के साथ लगे 96 पिपेट सिर का उपयोग करें. Permeabilization के बफर (0.1% ट्राइटन-x 100) के साथ intracellular लक्ष्य के लिए बाध्य एंटीबॉडी की सुविधा के लिए सेलुलर झिल्ली permeabilize. अच्छी तरह से कमरे के तापमान (आरटी) में एक 15 मिनट ऊष्मायन के लिए microplate स्टेकर की दूसरी भंडारण पत्रिका के लिए प्लेटें लौटने से पहले प्रत्येक में permeabilization के बफर (100 μl) बांटना.
  3. Permeabilization के बफर और पीई निकालेंपीबीएस (दो बार) के साथ rform प्लेट धोने के रूप में पहले कदम के 1.13 में वर्णित है.
  4. पिछले धोने के कदम के बाद, पीबीएस बफर और आरटी पर 1hr ऊष्मायन के लिए थाली पत्रिका के लिए उन्हें लौटने से पहले सभी microplates में पीबीएस में 1% घोड़े सीरम और 0.1% के बीच 20 से युक्त अवरुद्ध बफर के 100 μl बांटना हटा दें.
  5. Immunostaining के लिए दो प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: एक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी माउस BACS एंटीबॉडी, पूरी लंबाई की तस्वीर-25 और एक माउस मोनोक्लोनल विरोधी तृतीय ट्यूबिलिन एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए न्यूरॉन्स (सामग्री और उपकरण देखें) का पता लगाने के लिए. ऊष्मायन के 60 मिनट के बाद, बफर अवरुद्ध हटाने और सभी प्लेटों में बफर अवरुद्ध में 4ug / एमएल BACS एंटीबॉडी की और तृतीय ट्यूबिलिन के 0.5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की 50 μl बांटना.
  6. आर टी 0.05% बीच (PBST) युक्त पीबीएस के 100 μl के साथ 3 बार प्राथमिक एंटीबॉडी हटाने और धोने पर 1hr के लिए सेते हैं.
  7. एलेक्सा एफ के साथ टैग -III ट्यूबिलिन और विरोधी खरगोश आईजीजी कल्पना करने के लिए एलेक्सा Fluor 647 के साथ लेबल एक विरोधी माउस आईजीजी का प्रयोग करेंluor 568 BACS एंटीबॉडी कल्पना करने के लिए. बफर अवरुद्ध में एक 2 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर कमजोर पड़ने के रूप में दोनों एंटीबॉडी तैयार है और अच्छी तरह से प्रत्येक में मिश्रण के 50 μl बांटना.
    नोट: immunostaining के लिए चयनित माध्यमिक एंटीबॉडी उच्च सामग्री इमेजर की डिटेक्टर के भीतर विभिन्न चैनलों का उपयोग अलग तरंग दैर्ध्य उनके उत्सर्जित फ्लोरोसेंट रोशनी का पता लगाने की अनुमति के लिए विभिन्न fluorophores के साथ लेबल रहे हैं.
  8. आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. माध्यमिक एंटीबॉडी Aspirate और PBST के 100 μl के साथ 3 बार धोएं.
  9. अंतिम धोने के बाद, नाभिक का पता लगाने के लिए डीएनए दाग पीबीएस युक्त Hoechst डाई (32 माइक्रोन) के 100 μl जोड़ें.
  10. Photobleaching से fluorophores की रक्षा के लिए एक प्रकाश अभेद्य फिल्म के साथ प्लेटें सील. प्लेट्स 4 में संग्रहित किया जा सकता है   संकेत की महत्वपूर्ण नुकसान के बिना सप्ताह के लिए सी °.

3. इमेजिंग

नोट: उच्च सामग्री इमेजिंग व्यवस्था का उपयोग कर छवि अधिग्रहण प्रदर्शनमंदिर (सामग्री और उपकरण देखें).

  1. उच्च सामग्री इमेजर परिभाषाओं की विशिष्टता:
    1. चयन प्लेट प्रकार, लेआउट, क्षेत्रों की संख्या, उद्देश्य: Greiner यू स्पष्ट, 20X पानी क्रमशः 96 प्रारूप, 16,.
    2. चैनल चुनें: नाभिक उत्तेजना पूर्व: चैनल 4 के रूप में 405 एनएम; कोशिका द्रव्य पूर्व: 2 चैनल के रूप में 644 एनएम; प्रतिजन विशिष्ट एंटीबॉडी चैनल पूर्व: 561 चैनल के रूप में 3 एनएम और प्रत्येक लेजर का सेट अप उत्तेजना शक्ति, 2 जोखिम के रूप में स्थापना प्रयोग, 644 एनएम पर एक उत्तेजना, 405 एनएम और 561 एनएम पर दो excitations साथ एक्सपोजर 2 के साथ एक्सपोजर 1. Bin2 रूप binning चुनें.
    3. तस्वीर 25 चैनल और न्यूनतम तीव्रता के लिए कम नियंत्रण कुओं के रूप में अधिकतम तीव्रता के साथ लोगों तक पहुंचाने के अनुकूलन के लिए उच्च नियंत्रण कुओं का प्रयोग करें.
    4. प्रत्येक चैनल की तीव्रता संतृप्ति स्तर (2,000-2,500 रिश्तेदार यूनिट) के आधे के बारे में है, ताकि जोखिम को समायोजित.
    5. डेल्टा सुधार स्क्रिप्ट का उपयोग सेल मुखौटा चैनल पर इष्टतम जेड विमान को पहचानें. देखें फ़ाईimmunostaining और इमेजिंग के बाद परिणाम के लिए gure 5. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर रह रहा है, जहां सर्वर के लिए निर्यात डेटा.

4. छवि विश्लेषण (चित्रा 6)

नोट: निम्न चरणों कोलंबस सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम के आवेदन का वर्णन.

  1. प्राथमिक वस्तुओं (नाभिक) क्षेत्र के लिए एक उपयुक्त एल्गोरिथ्म का चयन करें. यदि आवश्यक हो, पृष्ठभूमि सीमा और इसके विपरीत मापदंडों को समायोजित. कोलंबस सॉफ्टवेयर 4 नाभिक तरीकों का पता लगाने प्रदान करता है. नेत्रहीन खंडों नाभिक का निरीक्षण द्वारा सही रूप में खंड नाभिक (एफ igure 6A विधि एम में चुना जाता है) कि विधि का चयन करें.
  2. यदि आवश्यक हो, खंड को neurites neurite एल्गोरिथ्म (सीएसआईआरओ neurite विश्लेषण 2) का चयन पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए पृष्ठभूमि सीमा और इसके विपरीत मापदंडों को समायोजित. Neurites पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों के लिए चित्रा 6B देखें.
  3. Neurite क्षेत्रों (neurite क्षेत्रों) बस पहचानेंएड β-III ट्यूबिलिन चैनल मुखौटा (चित्रा 6C) के रूप में (एलेक्सा मैदा 640) की एक -3 पिक्सेल विस्तार का उपयोग माध्यमिक वस्तुओं (neurites) पर.
  4. Neurites क्षेत्र और β-III ट्यूबिलिन चैनल (चित्रा 6D और 6E) के लिए संकेत चैनल (तस्वीर-25, (एलेक्सा मैदा 568) की तीव्रता की गणना.
  5. ऐसे neurite लंबाई, तस्वीर 25 का मतलब तीव्रता, β-III ट्यूबिलिन, नाभिक संख्या, neurite खंड संख्या, आदि (चित्रा 6F) के रूप में निर्यात के लिए वांछित मापदंडों का चयन करें.
  6. छवि अधिग्रहण के लिए उच्च सामग्री इमेजर में रोबोट और लोड का उपयोग थाली स्टेकर से स्थानांतरण प्लेटों.

5. डेटा विश्लेषण:

बनाया गया परख की मजबूती का आकलन करने के लिए, थाली-आधारित प्रयोग से निम्नलिखित मापदंडों की गणना.

  1. पृष्ठभूमि के लिए सिग्नल (एस) (बी): कम संकेत नियंत्रण के एस / बी = मतलब /) उच्च संकेत नियंत्रण की तीव्रता मतलब तीव्रता
    2. <, तरल से निपटने में परिवर्तनशीलता का निर्धारण करने के लिए, सी वी = (मानक विचलन (एसडी) का नमूना / मतलब) * 100 (%): ली> संकेत और पृष्ठभूमि की भिन्नता (सीवी) के गुणांक (विशिष्ट संकेत की एकरूपता को मापने के लिए) अभिकर्मकों, आदि
  2. शोर करने के लिए सिग्नल: एस = - कम नियंत्रण के / एसडी (संकेत की तीव्रता मतलब कम संकेत नियंत्रण की तीव्रता मतलब है)
    1. एक एक 96 अच्छी तरह से थाली का आधा और दूसरे आधे से एक नकली नशा का नशा साथ जेड 'कारक की गणना. जेड '= 1 - 3 * (उच्च संकेत नियंत्रण + कम संकेत नियंत्रण के एसडी के एसडी) / (उच्च संकेत नियंत्रण का मतलब है - कम संकेत नियंत्रण का मतलब है). स्क्रीनिंग डेटा के आगे के विश्लेषण के लिए, एक थाली आधार पर प्राथमिक कच्चे मापदंडों की तुलना में कुछ प्लेटों के बीच और प्रयोगों के अलग अलग दिनों के बीच की अनुमति के लिए मानक के अनुसार.
  3. % विखंडन = 100% * (विदेश मंत्रालय: पूर्ण लंबाई तस्वीर 25 विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया (BACS) के साथ जुड़े संकेत की कमी को दर्शाती दरार का प्रतिशत,उच्च संकेत नियंत्रण के एन तीव्रता - नमूना की तीव्रता) / उच्च संकेत नियंत्रण की तीव्रता मतलब है.
  4. दरार का निषेध का प्रतिशत:% निषेध = 100% * - / (- कम संकेत नियंत्रण की तीव्रता मतलब उच्च संकेत नियंत्रण की तीव्रता मतलब) (नमूना की तीव्रता कम संकेत नियंत्रण की तीव्रता मतलब है).

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Representative Results

उच्च और निम्न नियंत्रण से डाटा 3 मानक विचलन (चित्रा 7A) से अधिक दो medians के अंतर के साथ दो अलग आबादी बनाया. जांच प्रक्रिया का लक्ष्य नमूना जनसंख्या (चित्रा 7B, (मैं)) के भीतर एक सामान्य वितरण मानते हुए करीब सकारात्मक नियंत्रण आबादी के मूल्यों के साथ नमूना जनसंख्या भीतर यौगिकों को मिल रहा है. मतलब परे 3 मानक विचलन कर रहे हैं कि डेटा बिंदुओं शोर से सांख्यिकीय अलग माना जाता है और एक सक्रिय 'हिट' के रूप में वर्गीकृत किया जाता है (चित्रा 7B (द्वितीय), लाल बॉक्स). 'हिट' के रूप में वर्गीकृत किया जाता है कि यौगिकों भविष्य पढ़ाई में आगे की पुष्टि के परीक्षण के अधीन किया जाएगा. (द्वितीय) स्क्रीनिंग प्लेटों के एक प्रतिनिधि सबसेट से नमूनों की जनसंख्या में सकारात्मक हिट का पता लगाने से पता चलता है 7B चित्रा. से कम मूल्यों था कि सब 4 अंक (मंझला नमूने - 3 * नमूने के एसडी) का था4 अलग स्क्रीनिंग प्लेटों के भीतर विभिन्न स्थानों में देखा गया था कि एक ही अवरोध करनेवाला. चित्रा 5 में दिखाया गया है इस अवरोध, BoNT / ए के खिलाफ मजबूत तस्वीर 25 संरक्षण का प्रदर्शन किया.

चित्रा 1
चित्रा 1: BoNT / ए एचसीआई परख में यौगिक स्क्रीनिंग के लिए कार्यप्रवाह.

चित्रा 2
चित्रा 2:. एचसीआई परख के लिए 96 अच्छी तरह से थाली नक्शा उच्च नियंत्रण कुओं (गुलाबी) केवल नियंत्रण और 1 एनएम BoNT / ए और 0.5% DMSO के साथ इलाज किया गया कम नियंत्रण कुओं (नीला) के रूप में 0.5% DMSO के साथ इलाज किया गया. नमूना कुओं (हरा) 1Nm विष के साथ इलाज किया और यौगिकों के 10 माइक्रोन में 0.5% DMSO के थे. बाहरी स्तंभों और पंक्तियों (ग्रे) अनुकूलित प्लेट के लिए साथ असंगति के कारण इस्तेमाल नहीं किया गयाचटाई और छवि बढ़त वेल्स को 20X पानी विसर्जन उद्देश्य की असमर्थता.

चित्रा 3
चित्रा 3:. Immunostaining परख के लिए स्वचालित काम स्टेशन डेक के डिजाइन अवरुद्ध बफर, प्राथमिक एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी और सेलुलर दाग मृत मात्रा अभिकर्मक नुकसान को कम करने के लिए 96 अच्छी तरह polypropylene के प्लेटों में तिरस्कृत किया गया. पीबीएस 300 मिलीलीटर धारण करने में सक्षम एक ट्रे में तिरस्कृत किया गया था. तरल अपशिष्ट आकांक्षा के लिए इस्तेमाल कई गुना इनसेट छवि पर दिखाया गया है.

चित्रा 4
चित्रा 4: की स्थापना की उच्च सामग्री इमेजर प्रयोगात्मक का स्क्रीन शॉट.

चित्रा 5
एनजी> चित्रा 5:. माउस ते व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स में तस्वीर 25 दरार के उच्च सामग्री इमेजिंग कोशिकाओं के साथ और अवरोध करनेवाला (Toosendanin) 14 या विष के बिना छोड़ दिया इलाज की 1 माइक्रोन के अलावा बिना 1 एनएम BoNT / ए के साथ इलाज किया गया. तस्वीर 25 BACS एंटीबॉडी के साथ पाया गया. एक अन्य चैनल में, न्यूरॉन्स तस्वीर 25 छवि विश्लेषण के लिए neurites की मुखौटा बनाने के लिए एक β-III ट्यूबिलिन एंटीबॉडी का उपयोग पाया गया. यह अच्छी तरह से दिए गए एक से लिया 16 छवियों में से एक से एक भी प्रतिनिधि छवि है. ब्लू लाल BACS संकेत है और हरे β-III ट्यूबिलिन संकेत है, Hoechst 33342 के साथ दाग नाभिक को इंगित करता है. के रूप में वर्णित छवियां ओपेरा के साथ प्राप्त किया गया. आकार बार: 10 माइक्रोन

चित्रा 6
चित्रा 6: छवि विश्लेषण पाइपलाइन में विभिन्न चरणों दिखा स्क्रीन शॉट्स.

एस "> चित्रा 7
चित्रा 7: एचसीआई स्क्रीन से उत्पन्न होने वाले डेटा के सांख्यिकीय दृश्य. (ए). (मैं) नियंत्रण कुओं से गणना% विखंडन के बॉक्स साजिश विश्लेषण; अपने-अपने एसडी (एन = 16) के साथ के रूप में मंझला मूल्यों दिखाया. गुलाबी उच्च संकेत नियंत्रण (एचएससी) का प्रतिनिधित्व करता है; नीले कम संकेत नियंत्रण (LSC) का प्रतिनिधित्व करता है. जेड '= 0.97 (द्वितीय) (मैं) के रूप में ही मूल्यों की हिस्टोग्राम वितरण दो नियंत्रण आबादी के बीच की दूरी प्रदर्शित करने के लिए. माध्य और 3 एसडी इसी बॉक्स साजिश के साथ जुड़ा सांख्यिकीय मूल्यों से गणना की गई. (बी). 192 परिसर के वितरण ही प्रयोग से नमूने का इलाज किया. (मैं) नियंत्रण करने के लिए तुलना के साथ ही महत्वपूर्ण सांख्यिकीय outliers में नमूने के लिए% दरार के लिए सांख्यिकीय मूल्यों का प्रदर्शन बॉक्स साजिश है. (Ii) और (iii) स्क्रीन से सभी डेटा की आबादी में एक ही मूल्यों का हिस्टोग्राम वितरण (हरारंग). (लाल चौक में प्रकाश डाला) हिट्स,% दरार नमूना जनसंख्या (<25.89% दरार) की औसत से 3SD से कम मूल्यों है कि outliers से चयन किया गया था. चार हिट चयन के दौरान प्रकाश डाला (iii) सभी डेटा बिंदुओं की हिस्टोग्राम पर उच्च संकेत नियंत्रण के समान मूल्यों और, एक ही परिसर में प्रतिनिधित्व तस्वीर अवरुद्ध है कि परीक्षण के लिए थाली, एक ज्ञात BoNT / एक अवरोध करनेवाला (Toosendanin) में नुकीला -25 दरार.

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Discussion

बोटुलिनम न्यूरोटोक्सिन और उनके weaponization के रिश्तेदार आसानी से उच्च शक्ति रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए अमेरिकी केंद्र द्वारा श्रेणी ए (सर्वोच्च प्राथमिकता) biothreat एजेंट के रूप में उनके वर्गीकरण में हुई है. दुर्भाग्य से, कोई एफडीए विष मोटर न्यूरॉन्स द्वारा भली भाँति किया गया है के बाद BoNT नशा मुकाबला करने के लिए चिकित्सा विज्ञान अनुमोदित कर रहे हैं. BoNT नशा से न्यूरोनल वसूली को बढ़ावा देता है कि किसी भी druggable तंत्र इस जैविक खतरे के खिलाफ सशस्त्र सेवाओं और सार्वजनिक दोनों की रक्षा के लिए एक संभावित चिकित्सा के विकास की ओर ले जा सकता है. इस अनुच्छेद में, हम इस तरह के BoNT / ए के रूप में घातक विषाक्त पदार्थों के अवरोधकों स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत एचसीआई परख प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस परख की एक असामान्य पहलू प्रयोगशाला सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए विषाक्त पदार्थों और सख्त जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन की धर्मभीरु सौंपने है. सक्रिय विष उपयोग में है जबकि अत्यधिक ध्यान प्रयोग किया जाना चाहिए. BoNT / मेथनॉल निर्धारण और microplate decontaminati के माध्यम से एक निष्क्रियता10% ब्लीच और 5% के साथ पर सतह पोंछे जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला वातावरण में नीचे की ओर मूल्यांकन के लिए जैव सुरक्षा मंत्रिमंडल से हटा दिया जाना microplates कि अनुमति देने के महत्वपूर्ण कदम हैं.

कारण धीमी गति से मोटर न्यूरॉन विस्तार (सेल नंबर) के साथ मिलकर मिश्रित पुस्तकालयों की कभी विस्तार आकार के लिए, न्यूरोटॉक्सिन गरम लिए एचसीआई assays के कई हफ्तों से अधिक चलाने के लिए करते हैं. इस प्लेटों के बीच और समय भर में परिवर्तनशीलता सफाया या कम से कम किया जाना चाहिए कि आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल में हम immunostaining, छवि अधिग्रहण और परख परिवर्तनशीलता को कम करने के विश्लेषण के लिए स्वचालन तरीकों प्रदान करते हैं. इसके अलावा विश्वसनीयता और स्थिरता सेल चढ़ाना, कपड़े धोने, और निर्धारण सहित इस प्रोटोकॉल के साथ जुड़े दिनचर्या कार्यों के स्वचालन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हमारे समूह वर्तमान में निकट भविष्य में हमारे प्रोटोकॉल में उन्हें शामिल करने के इरादे के साथ इन सुधारों के प्रभाव का मूल्यांकन किया जाता है.

इस रिपोर्ट में, हम एक तस्वीर-25 का वर्णनमोटर न्यूरॉन्स में बरकरार तस्वीर-25 के सापेक्ष प्रतिदीप्ति मापने के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग का उपयोग दरार परख. इस परख पूर्ण लंबाई तस्वीर 25 और β-III ट्यूबिलिन क्रमशः 11 का पता लगाने के लिए BACS और β-III ट्यूबिलिन एंटीबॉडी का उपयोग करता है. β-III ट्यूबिलिन विशेष रूप से न्यूरॉन्स (चित्रा 4) की पहचान करने के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. BoNT / ए cleaves तस्वीर 25 और तस्वीर-25 संकेत को कम कर देता है, इस प्रक्रिया के किसी भी हिस्से को बाधित कि छोटे अणुओं इमेजिंग परख स्नैप-25 संकेत सुधार. इस परख कई छोटे neurites भर में वितरित तस्वीर 25 से उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत पर निर्भर करता है, उच्च गुणवत्ता के चित्र बिल्कुल जरूरी हैं. इसलिए, उच्च संकल्प confocal छवियों का उत्पादन है कि स्वचालित माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) की सिफारिश की है. 20X पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करते समय हम नियमित रूप से अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में / 6-16 क्षेत्रों पर कब्जा. क्षेत्र के imaged की संख्या generat करने के लिए आवश्यक neurites की कुल संख्या पर निर्भर हैंसांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम ई.

मॉड्यूलर छवि विश्लेषण एल्गोरिदम Multiparameter डेटा (चित्रा 6) को निकालने के लिए उपयोग किया गया. कोलंबस मॉड्यूलर छवि विश्लेषण एल्गोरिदम सरल विश्लेषण परिदृश्यों के लिए उत्पन्न करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं. अधिक जटिल विश्लेषण या जटिल readouts के लिए विशिष्ट मापदंडों के डिजाइन के लिए, Acapella आधारित स्क्रिप्ट ओपेरा पर्यावरण के भीतर के साथ ही कोलंबस के संदर्भ के अंदर इस्तेमाल किया जा सकता है. तस्वीर 25 और β-III ट्यूबिलिन चैनलों से प्राप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता के अलावा, हम नियमित दौरान न्यूरोनल स्वास्थ्य यों इस तरह कुल सेल नंबर (cytotoxicity के लिए अप्रत्यक्ष उपाय), neurite लंबाई, neurite शाखाओं में बंटी, और अन्य समापन के रूप में अन्य मानकों इकट्ठा परख. कच्चे समापन बिंदु डेटा आगे डेटा विश्लेषण और मारा चयन (चित्रा 7) के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर को निर्यात कर रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत डेटा effici होने की एचसीआई परख की क्षमता को दर्शाता हैently एक physiologically प्रासंगिक मोटर न्यूरॉन मॉडल का उपयोग BoNT / ए अवरोधकों के लिए खोज में प्ररूपी स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Botulinum neurotoxin A  Metabiologics NA No catalog number
Microtitre plates Greiner  655946 Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody Lampire Biological NA
Microchem National  0255
Methanol Thermo Scientific A412-20
Formaldehyde Thermo Scientific 28908
Horse serum Invitrogen 16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation Perkin Elmer AJMDT01
Opera Perkin Elmer OP-QEHS-01
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
BIII tubulin antibody R&D Systems BAM1195
Tween 20 Sigma P1379-1L
Hoechst 33342dye  Invitrogen 3570
Antimouse IgG Invitrogen A21236
Anti rabbit IgG Invitrogen A10042
Columbus Image analysis software Perkin Elmer Ver 2.4
Spotfire Perkin Elmer Ver 5.5
Clorox bleach Fisher Scientific 18-861-284
PlateStack

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 93 तंत्रिका विज्ञान तंत्रिका जीव विज्ञान बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन, उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली न्यूरोटॉक्सिटी
बोटुलिनम Neurotoxin inhibitors के पहचान के लिए एक उच्च सामग्री इमेजिंग परख
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Kota, K. P., Soloveva, V., Wanner,… More

Kota, K. P., Soloveva, V., Wanner, L. M., Gomba, G., Kiris, E., Panchal, R. G., Kane, C. D., Bavari, S. A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors. J. Vis. Exp. (93), e51915, doi:10.3791/51915 (2014).

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