Summary
DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.
Abstract
-Adenosyl S-L-metionina (AdoMet ou SAM) metiltransferases dependentes de (MTAse) catalisam a transferência do grupo metilo de AdoMet activado a posições específicas no ADN, ARN, proteínas e pequenas biomoléculas. Esta reacção de metilação pode ser natural, expandida para uma grande variedade de reacções de alquilação usando análogos sintéticos de cofactor. A substituição do centro reactivo da AdoMet sulfónio com um anel aziridina leva à co-factores que podem ser acoplados com ADN por vários MTases ADN. Estes cofactores de aziridina pode ser equipado com grupos repórter em diferentes posições a porção de adenina e usado para S-specific equence M ethyltransferase- I nduced ing L abel de DNA (DNA de sorriso). Como um exemplo típico, damos um protocolo para a biotinilação de DNA de plasmídeo pBR322 na sequência 5'-ATCG A T-3 'com o ADN MTase M.BseCI e o cofactor aziridina em 6BAzum passo. Extensão do grupo metil ativado com insaturados grupos alquilo resulta em uma outra classe de análogos AdoMet que são utilizados para dirigida por ethyltransferase m T ransferência de A ctivated rupos G (mTAG). Uma vez que as cadeias laterais estendidas são activados pelo centro de sulfónio e a ligação insaturada, estes cofactores são chamados análogos AdoMet dupla activada. Estes análogos não só funcionam como co-factores para MTases ADN, como os cofactores de aziridina, mas também para ARN, proteínas e pequenas MTases molécula. Eles são tipicamente usados para a modificação enzimática da MTAse substratos com grupos funcionais únicos que são marcados com grupos repórter num segundo passo químico. Isso é exemplificado em um protocolo para a rotulagem de fluorescência da proteína histona H3. Um pequeno grupo propargilo é transferido do SeAdoYn cofactor análogo à proteína pela lisina histona H3 4 (H3K4) MTase SET7 / 9 seguido por clique rotulagem dohistona H3 alkynylated com TAMRA azida. Rotulagem MTase mediada com análogos cofactor é uma tecnologia capacitadora para muitas aplicações interessantes, incluindo a identificação e estudo funcional de substratos MTase bem como genotipagem de DNA e detecção de metilação.
Introduction
Rotulagem específica de ácidos nucléicos e proteínas 1,2 3,4 é de grande interesse para caracterizações funcionais, diagnóstico médico e (nano) biotecnologia. Aqui apresentamos um método de marcação enzimática para esses biopolímeros que é baseada no S -adenosyl-l-metionina (AdoMet ou SAM) methyltransferases -dependentes (MTases). Esta classe de enzimas (EC 2.1.1.) Tem como alvo as posições individuais nucleofílicos (azoto, oxigénio, enxofre e átomos de carbono) no interior resíduos específicos de ácidos nucleicos e proteínas e naturalmente transfere o grupo metilo activado da AdoMet cofactor (Figura 1A) 5. Além disso, pode utilizar MTases análogos sintéticos de cofactor para marcação específica com fluoróforos, marcadores de afinidade ou outras etiquetas (Figura 1B) 6. Duas classes de análogos da AdoMet foram desenvolvidos: cofactores aziridina para M ethyltransferase- específico equence S-I L abel ING (sorrindo) 7 e duplos análogos ativados AdoMet para dirigida por ethyltransferase m T ransferência de A ctivated rupos G (mTAG) 8.
Figura 1: As reacções catalisadas por metiltransferases (MTases) de transferência de grupo A. Metil do cofactor naturais AdoMet (SAM) a vários substratos, incluindo ADN, ARN, proteínas e pequenas biomoléculas B. Etiquetagem / funcionalização de ácidos nucleicos e proteínas (NNNNN. =. pares de bases de DNA, nucleotídeos de RNA para ácidos e aminoácidos das proteínas; XXXXX = sequência de reconhecimento do MTase com resíduo alvo em verde) com análogos cofactor sintéticos. Cofatores Aziridine contendo um grupo repórter (esfera azul)ligado ao anel de adenina são especificamente sequência acoplado com o resíduo alvo (esquerda) e análogos dupla activada AdoMet conduzir à transferência de cadeias alquilo que transportam um repórter estendidos química Y (direita), que podem ser marcados por reacção bioorthogonal clique num segundo passo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Cofatores Aziridine trabalhar melhor com DNA MTases. Eles contêm um anel de três membros, com um átomo de azoto, 9 (ou um seu N mostarda 10,11) em vez do centro do grupo de sulfónio como reactivo. A protonação do átomo de azoto presente no anel de aziridina activa para o ataque nucleofílico pelo nucleotídica alvo que leva para o acoplamento covalente de todo o co-factor com ADN. Ao ligar-se grupos repórter para o anel de adenina os cofactores de aziridina pode ser utilizado em combinação com DNA para rotular MTases ADN em um passo (
Figura 2:. Sequência de biotinilação específica de um passo de ADN com M.BseCI e 6BAz O ADN MTase M.BseCI reconhece a sequência de ADN de cadeia dupla 5'-ATCG A T-3 'e naturalmente metila o grupo amino da segunda adenina resíduo (verde) usando AdoMet. Com o co-fator aziridine 6BAz o curso da reacção é alterada e M.BseCI leva para sequenciar biotinila�o DNA específico acoplando todo o cofator incluindo biotina (azul) com a adenina alvo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Duplos análogos AdoMet activados contêm estendido cadeias laterais insaturadas em vez de um grupo metilo no centro de sulfónio (Figura 1B 20. A ligação dupla ou tripla insaturada em β-position para o centro da sulfonium compensa eletronicamente efeitos estéricos desfavoráveis no interior do estado de transição de estabilização conjugative. Uma vez que tanto o centro de sulfonium ea ligação insaturada ativar a cadeia lateral para a transferência enzimática, estes cofatores foram nomeados análogos AdoMet double-ativadas. Tipicamente, eles são utilizados para transferir as cadeias laterais com grupos repórteres únicos químicos (químicos), como grupos amino, alquino e azida, para rotulagem quimio-selectiva numa segunda etapa 8,21. Em geral, os análogos dupla ativada AdoMet pode não só funcionam como co-fatores para DNA MTases 8,20,21, mas também para RNA MTases 22,23 e MTases proteína 24-28 permitindo rotulagem adicional de RNA e proteínas. No entanto, as cadeias laterais estendidas estão estericamente mais exigente do que um grupo metilo e alargando os locais activos MTAse por engenharia de proteínas é frequentementeen necessária para a obtenção de taxas de transferência eficientes. Outra solução para este problema é a utilização de um análogo AdoMet com um grupo pequeno propargilico (três carbonos), onde o terminal de alcino tem duas funções: 1. Estabilização do estado de transição durante a transferência enzimática e 2. alça reativos para seguir modificações químicas por cobre- catalisada cicloadi�o azida-alcino (CuAAC) clique química. Descobriu-se que o resultante propargílica AdoMet análogo 29 é bastante instável em condições neutras ou ligeiramente básicas e somente de uso limitado. Este inconveniente pode ser corrigido, substituindo o átomo de enxofre com selênio. O cof actor resultante 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-desoxiadenosina (SeAdoYn, Figura 3) é aceite pelo ADN de tipo selvagem, ARN e MTases proteína 30-32 que anula a necessidade de engenharia de proteínas, em muitos casos. Isto é exemplificado por fluorescência pró rotulagem tein com a lisina histona H3 4 (H3K4) MTase SET7 / 9 33 (Figura 3, ver seção de protocolo 3: marcação de proteínas em dois passos via cofatores ativados duplas).
Figura 3:. Específica da sequência de fluorescência de duas etapas rotulagem de histona H3 com SET7 / 9, SeAdoYn e TAMRA azida A proteína MTase SET7 / 9 naturalmente metila o grupo amino da lisina 4 em histona H3 (H3K4, verde) usando AdoMet. Com o co-fator duplo ativado SeAdoYn o MTase transfere um grupo propargilico pequeno (vermelho) ao resíduo de lisina. A ligação tripla terminal conectado é então modificada seletivamente em uma reação clique bioorthogonal (azida-alcino cicloadi�o catalisada por cobre, CuAAC) com (tetramethylrhodamine, azul) fluorophore derivado-azida TAMRA.carga / 52014 / "target =" _ 52014fig3highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Instruções Gerais
- Aziridina loja cofactor 6BAz (em DMSO) e proteína MTase SET7 / 9 a -80 ° C e todos os outros reagentes, incluindo co-factor activado SeAdoYn dupla e ADN MTase M.BseCI (em glicerol a 50%) à temperatura de -20 ° C.
- Determinar a concentração de 6BAz e SeAdoYn via UV / Vis utilizando os coeficientes de extinção ε 269nm (6BAz) = 16,000 centímetros -1 M-1 e ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 centímetros -1 M-1 em água deionizada. Determinar a concentração de MTases pelo ensaio de Bradford ou, se o coeficiente de extinção está disponível, por meio de absorção directa a 280 nm.
- Tentar evitar a criação de bolhas por pipetagem intensivo ou em vortex para evitar a perda de actividade da enzima. Em vez disso, misture cuidado pipetando para cima e para baixo.
- Quando a adição de co-factores de aziridina partir de soluções mãe em DMSO a certificar-se de que a concentração final de DMSO no ensaio é de menosdo que 5%. Sempre incluir 10 mM de iões de magnésio no tampão de ensaio para evitar reacções não específicas com o ADN.
- Quando a adição de co-factores activados duplas a partir de soluções de estoque ácidas utilizar pequenos volumes (soluções de reserva altamente concentrada) para evitar a variação do pH e certificar-se de que o pH da solução de ensaio não se altera significativamente. Evitar, por exemplo, tióis, β-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT), em tampão de ensaio, porque eles podem interferir com a reacção de cliques por complexação dos iões de cobre necessários.
2. Um passo Rotulagem de DNA via Aziridine Cofactores
- Específica da sequência Induzido por Metiltransferase Etiqueta ing (sorrindo) de DNA plasmídeo com M.BseCI DNA MTase e aziridine cofator 6BAz.
- Descongelar o cofactor solução a 20 ° C e preparar as misturas de reacção em gelo.
- Além de realizar um ensaio de controlo "cofactor", para visualizar as modificações não específicas, e um & #8220; enzima "controle, para se certificar de que a preparação MTase está livre do AdoMet cofator natural.
- Para a mistura do ensaio 2 ul de tampão de modificação 10x (contendo 100 mM de Tris-HCl, 100 mM de MgCl 2, 20 mM de β-mercaptoetanol, pH 7,4), 2 uL do pBR322 (0,5 ug / uL), 10 eq. M.BseCI por sequência de reconhecimento no ADN (sequência de reconhecimento em pBR322 1) e o cofactor aziridina 6BAz para uma concentração final de 60 pM num volume total de 20 ul. Adicionar cofator e DNA MTase passada.
NOTA: β-mercaptoetanol é tóxico, corrosivo e prejudicial para o ambiente. - Para o controle "cofator" adicionar água deionizada em vez de M.BseCI e para o controle de "enzima" adicionar água deionizada em vez de 6BAz.
- Misture as soluções cuidado pipetando para cima e para baixo.
- Incubar os tubos a 55 ° C durante 1 h.
- Centrifugar brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior dos tubos.
- Ensaio restrição-modificação para verificar modificação DNA.
- Prepara-se uma solução por mistura de 10 ul de tampão 10x R.TaqI (contendo 100 mM de Tris-HCl, 50 mM de MgCl 2, 1 M de NaCl, 1 mg / ml de albumina de soro bovino, pH 8,0), 80 ul de água desionizada e 3,3 mL da endonuclease de restrição (Rease) a partir de Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / ul). Certifique-se de adicionar o Rease na última etapa.
- Para cada tubo de 2.1.7 adicionar 2 ul de tampão Taq 10x R. e 28 ul da solução a partir de acima (2.2.1).
- Misture as soluções cuidado pipetando para cima e para baixo.
- Incubar os tubos a 65 ° C durante 30 min.
- Centrifugar brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior dos tubos.
- Teste de desvio de Electromobility (EMSA) com estreptavidina para verificar modificação funcional.
- Remover 25 mL de cada tubo (2.2.5) e adicionar 2,4 mL de uma solução de estreptavidina (1 mM com respeito a estreptavidina monomer estreptavidina em tampão contendo 100 mM de Na 2 HPO 4, NaCl 100 mM, pH 7,5; 4 equivalentes de biotina total). Adicionar 2,4 mL de tampão de estreptavidina para os restantes tubos.
- Incubar todos os tubos a 37 ° C durante 1 h.
- Análise através de electroforese em gel de agarose.
- Adiciona-se 5 mL de tampão de carregamento 6x (0,25% de azul de bromofenol, 30% de glicerol) a cada tubo.
- Misture delicadamente as soluções.
- Carga de 10 ul de cada amostra para os poços de um gel de agarose (1% de agarose em tampão TBE 0,5x contendo 1x GelRed a partir de uma solução estoque 10.000x).
- Execute o gel em tampão TBE 0,5x com 80 V por aprox. 1 hr.
- Visualizar as bandas de ADN numa mesa de UV (312 nm) com uma câmara CCD equipado com um filtro (540 ± 50 nm).
NOTA: a luz UV é prejudicial para os olhos e pele.
3. Duas fases de marcação de proteínas via casal Cofactores activados
- MethyltransfTransferência de Grupos ativado (mTAG) com SET7 / 9 e cofator double-ativado SeAdoYn para histona H3 lisina 4 rotulagem (etapa de modificação) apagar-dirigida.
- Descongelar os componentes e preparar as misturas de reacção em gelo. NOTA: Sempre mantenha SeAdoYn resfriado para evitar a degradação.
- Além de realizar um ensaio de controlo "cofactor", para visualizar as modificações não específicas, e um controlo de "enzima", para excluir as reacções não específicas da sonda fluorescente.
- Prepara-se uma solução de ensaio (20 ul) contendo tampão de modificação (50 mM Tris-HCl, 5% de glicerol, pH 8,5), 10 mM de histona H3, 10 uM SET7 / 9 e 600 uM SeAdoYn (mistura de ambos os epímeros em selénio). Nas últimas etapas adicionar cofator e depois MTase.
- Para o controlo "cofactor" preparar uma solução de ensaio como em 3.1.3 e adicionar AdoMet 60 mM para competir com o cofactor sintético. Para o controle de "enzima" adicionar água deionizada em vez de SeAdoYn.
- Misture as soluções por lentamente pipetagem cima e para baixo. Verificar o pH por adição de 1 ul de cada solução para o campo superior de uma faixa de pH (gama de pH de 5 - 10).
- Incubar a 37 ° C durante 2 horas.
- No gel entretanto preparar um gel de SDS-poliacrilamida a 12% (em execução: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) de APS, 0,04% (v / v) e TEMED a 12% de acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1 ; carregamento do gel: 357 mM Bis-Tris pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) de APS, 0,04% (v / v) e TEMED a 5% de acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1).
NOTA: A acrilamida / bisacrylamide é tóxico e nocivo à saúde. Usar luvas durante este procedimento.
- Rotulagem Chemical de lisina alkinylated 4 em histona H3 via cicloadi�o azida-alcino (CuAAC) (etapa de rotulagem) catalisada por cobre.
- Pouco antes do fim da reacção de modificação preparar uma mistura 5x clique contendo 3 mM de CuSO 4, 3 mM de tris (3-hidroxipropil-triazolilmetil) amina (THPTA), ascorbato de sódio 250 mM e TAMRA 6 mM de azida com umvolume total de 20 ul.
- Adiciona-se 5 uL da mistura de 5x clique recentemente preparada a cada tubo para iniciar a CuAAC e extingue-se a reacção de modificação.
- Misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo.
- Proteja todos os tubos com folha de alumínio da luz para evitar a foto-branqueamento do fluoróforo.
- Incubar a 20 ° C durante 1 h.
- Precipitação de proteínas para remover o excesso de livre fluorophore TAMRA.
- Para evitar resplendor da marcação fluorescente histona H3 por intensivo fluorescência in-gel de livre fluorophore TAMRA, retire o excesso fluorophore por precipitação de proteínas (3.3.2 - 3.3.4) 34.
- Adicionar 75 mL de metanol, 18,8 mL de clorofórmio e 50 ul de água desionizada a cada tubo e vortex brevemente após cada adição. Centrifuga-se a 16000 xg durante 5 min. Remover a fase superior sem perturbar a camada de interface, que contém a proteína.
- Adicionar 56,3 mL de metanol à fase restante in cada tubo, vortex e centrifuga-se a 16.000 xg durante 5 min para sedimentar a proteína. Remover o sobrenadante. Repetir esta etapa para lavar o sedimento.
- Cubra os tubos abertos com um tecido que não solte fiapos e deixe-os secar por 15-30 min.
- Análise via SDS PAGE.
- Dissolve-se as proteínas precipitadas a partir de 3.3.4 em 20 ul de tampão de carga SDS (50 mM Tris-HCl, 2,5% (w / v) de SDS, 10% (v / v) de glicerol, 320 mM β-mercaptoetanol e 0,05% (w / v) azul de bromofenol, pH 6,8). Certifique-se para dissolver completamente o sedimento, por lavagem das paredes dos tubos com uma pipeta.
- Incubar as amostras a 95 ° C durante 10 min e deixa-os arrefecer até 20 ° C.
- Centrifugar brevemente para recolher todo o líquido na parte inferior dos tubos.
- Coloque toda a quantidade de cada amostra para os poços de um gel de poliacrilamida SDS (3.1.7). Use 50 mM de MOPS, 50 mM de Tris-X (Tris-base), EDTA 5 mM, 0,1% (w / v) de SDS como tampão de corrida para electroforese.
- Execute o gel com 120 V por aprox. 90 min.
- Visualizar a fluorescência em gel sobre uma mesa de UV (312 nm) com uma câmara CCD equipado com um filtro (540 nm ± 50 nm).
NOTA: a luz UV é prejudicial para os olhos e pele.
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Representative Results
Um passo-a Rotulagem de DNA via Aziridine Cofactores
Esta reacção é levada a cabo exemplo com o ADN MTase M.BseCI, que modifica o resíduo de adenina segunda dentro do 5'-ATCG A T-3 'sequência de cadeia dupla e tem um local de reconhecimento no plasmídeo pBR322 (Figura 4A). Para testar rotulagem plasmídeo, pBR322 é desafiado com a endonuclease de restrição (Rease) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI tem sete sites na pBR322, um dos quais está incluído no site da M.BseCI. Se ocorre rotulagem, o local M.BseCI será protegido contra a clivagem e um novo fragmento com 683 pares de bases (pb) irá formar enquanto dois outros fragmentos desaparecerá (315 e 368 pb). É claro, quando se analisa de marcação de ADN com outros MTases REases ADN com diferentes sequências de reconhecimento correspondentes deve ser empregue.
O gel de agarose, a Figura 4B mostra claramente a aparecerdade de um novo fragmento com 683 pb (pista 3). Isso demonstra que a rotulagem do site M.BseCI ocorreu. Apenas o ensaio (pista 3) mostra que este fragmento. O controlo de "co-factor" (pista 5), bem como o controlo de "enzima" (pista 7) estão ausentes desta banda. Especialmente o controle "enzima" é importante porque demonstra que o co-factor natural, AdoMet não está presente na preparação enzimática. A especificidade da reacção de marcação é demonstrada pelo teste de desvio de mobilidade eléctrica (EMSA) com a adição de estreptavidina (Figura 4B e 4C em detalhe). Electromobility do 683 bp é retardado enquanto a mobilidade de todos os outros fragmentos sem local M.BseCI está inalterado em comparação com os controles (compare com a pista 4 pistas 6 e 8).
Figura 4: Sequênciabiotinilação específica de DNA do plasmídeo pBR322 com M.BseCI e 6BAz. A. O plasmídeo pBR322 que mostra o mapa de locais de reconhecimento para M.BseCI (vermelho) e R.TaqI (verde), bem como o comprimento dos fragmentos de DNA esperados em pares de bases (pb), após a restrição com R.TaqI. B. Análise de ADN fragmentação e EMSA por eletroforese em gel de agarose. M = Marker, faixas 1 e 2: DNA plasmídeo, pistas 3 e 4: ensaio, pistas 5 e 6: control 'cofator', pistas 7 e 8: controle "enzima". As pistas 2, 4, 6 e 8 contêm adicionalmente estreptavidina. C. alargada inserção de B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Duas fases marcação de proteínas via casal Cofactores ativadas
Como exemplo para a rotulagem de duas etapas de MTase substratos com análogos dupla ativada AdoMet escolhemos o histonaLisina H3 4 (H3K4) MTase SET7 / 9 eo pequeno cofator SeAdoYn. Após a transferência enzimática do grupo propargilo activado para o substrato histona H3 (primeiro passo), o alcino terminal é quimicamente modificado, marcado com um fluoróforo-azida TAMRA por CuAAC clique química (segundo passo) (comparar com a figura 3). A análise da reacção de marcação é feita por SDS-PAGE e detecção por fluorescência em gel (Figura 5A). O ensaio (pista 1) mostra uma banda fluorescente correspondente a histona H3 indicando que a cadeia lateral do cofactor foi transferido com sucesso e a proteína modificada marcado com o fluoróforo TAMRA. Nenhum bandas são visíveis na "co-fator" e controles "enzima" (faixas 2 e 3), demonstrando que a rotulagem de histona H3 é mediada pela MTase. Assim, a rotulagem química não-específica, quer pela cofator sozinho (primeira etapa) ou durante CuAAC (segunda fase) pode ser descartada. O controlo "cofactor" é realizada differently do que no protocolo de marcação de ADN de um só passo. Isto é porque a precipitação de histona H3 é mais eficiente na presença de SET7 / 9 e omitindo a proteína MTase pode levar a quantidades reduzidas de histona H3 no controlo de carga. Assim, adicionou-se uma elevada concentração do co-factor natural para AdoMet competir com SeAdoYn. Carregando de histona H3 pode ser facilmente controlada por coloração do gel com azul de Coomassie após a detecção de fluorescência.
Substratos de MTAse podem também ser marcados com biotina em vez de fluoróforos utilizando biotina-derivatizado de azida no segundo passo químico 30. A biotinilação de proteínas é convenientemente analisadas por transferência de Western com peroxidase de rábano silvestre conjugado com avidina. Isto é mostrado na Figura 5B para a biotinilação de histona H3 com SET7 / 9, SeAdoYn e biotina modificados com azida. O ensaio na pista 1 mostra uma banda clara para a histona H3 marcado. A ausência de bandas no "enzima" (pista 2)e "co-factor" de controlo (pista 3) demonstra novamente que a rotulagem é específico para a MTase. O controlo "cofactor" é simplesmente realizada na ausência de proteína MTase porque a análise de Western blot não requer a remoção do excesso de biotina por precipitação da proteína.
Figura 5: Rotulagem de histona H3 com a proteína MTase SET7 / 9 e SeAdoYn seguida por reações clique com rótulos derivado-azida. A. In-gel de fluorescência marcado com TAMRA-histona H3 e controles, bem como a coloração com Azul de Coomassie para o controlo de carga. A análise de mancha ocidental de B. biotinilado H3 e controlos utilizando peroxidase (HRP) conjugado de avidina-peroxidase de rábano histona. As condições experimentais foram muito semelhantes aos de marcação por fluorescência em A (modificação enzimática: 6,581; H histona H3, 10 uM SET7 / 9, 600 uM SeAdoYn, em 50 mM de Tris-HCl, 5 mM de MgCl 2, 5% de glicerol, pH 9,0, 30 ° C, 3 h; rotulagem química.: 0,6 mM CuSO4, THPTA 0,6 mM, ascorbato de sódio 50 mM, 1,2 mM biotina-azida, 37 ° C, 1 h) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Rotulagem de uma etapa de DNA com MTases DNA e cofatores aziridina (DNA sorrindo) é um método robusto, mas alguns aspectos devem ser considerados quando se planeja o experimento.
Cofactor aziridina: A concentração 6BAz para marcação de ADN com M.BseCI foi de 60 uM. Ao usar outros MTases DNA a concentração cofator deve ser otimizada, por exemplo, concentrações tão baixas como 20? M têm sido empregadas com o DNA MTase M.TaqI 19. Baixas concentrações 6BAz tem a vantagem de que um excesso de quatro vezes de estreptavidina (locais no que diz respeito a toda a quantidade de biotina no ensaio de ligação) pode ser adicionado directamente após incubação com Rease sem interferir com a análise por EMSA. Caso contrário, o ADN biotinilado deve ser purificado para remover o excesso de cofactor e evitar manchas de DNA durante a electroforese em gel de agarose. Quando a adição de co-factores de aziridina partir de soluções mãe em DMSO a certificar-se de que a concentração final de DMSO no the ensaio é inferior a 5%. Demasiada DMSO podem inativar as enzimas. Sempre armazenar aziridina cofactores a -80 ° C para evitar a degradação.
ADN MTase: acoplamento enzimático de co-factores de aziridina com ADN pode conduzir a produtos inibidores fortes e os MTases de ADN tem que ser usado em quantidades estequiométricas. Portanto, use sempre mais do que um equivalente de DNA MTase. A maioria dos MTases ADN copurify com AdoMet ligado que tem de ser removido por diálise extensiva ou lavar as enzimas em uma coluna com grandes volumes de tampão. O controle de "enzima" dirá se AdoMet ainda está presente na preparação enzimática. A marcação com M.BseCI também pode ser realizado por incubação durante a noite a 37 ° C.
Tampão Modificação: Incluir 10 íons de magnésio mM no buffer para evitar reações não específicas de cofatores aziridina com DNA. Se íons de magnésio levam à ativação de nucleases contaminantes, iões bário pode ser adicionado em seu lugar.
Para a rotulagem específica seqüência de DNA não só sorrindo DNA, mas também mTAG podem ser empregadas. Aqui dupla cofactores activados são usadas para a transferência enzimática de cadeias laterais com grupos funcionais únicos de ADN. Estes grupos funcionais, por exemplo, aminas primárias, podem ser modificados com uma vasta variedade de grupos repórter, incluindo biotina ou fluoróforos, por éster NHS química num segundo passo 8,35,36. Alternativamente, começamos a sintetizar duplas análogos AdoMet ativados com cadeias laterais grandes já que contêm o grupo repórter e usou-os para a rotulagem de DNA em uma única etapa.
O mTAG procedimento de etiquetagem de dois passos para proteínas com o co-factor activado dupla SeAdoYn tem sido utilizada com sucesso com um certo número de MTases proteína 30,31. No entanto, as seguintes observações devem ser considerados antes de realizar o experimento.
Duplo cofator ativado: Estes cofatores, incluindo o MardoYn, são armazenados sob condições ácidas e os cuidados devem ser tomados para que o pH da solução a modificação não altera significativamente com a adição de cofactor. Nós sempre verificar o pH por adição de 1 ul da solução de modificação para uma faixa de pH e, se o pH for demasiado baixo, adicionar pequenas quantidades de solução de hidróxido de sódio (50 mM) para ajustar o pH. Além disso análogos cofactor deve ser adicionado em um volume baixo para evitar mudanças de pH. Assim, as concentrações mínimas de cofactor necessário para a modificação completo deve ser determinada para outras MTases e são preferidas as soluções de co-factor altamente concentradas. As concentrações de cofactor são tipicamente variar entre 10 uM e 600 uM. A síntese química de cofactores dupla activado produz tipicamente cerca de uma mistura 1: 1 de epímeros em enxofre ou selênio e separação do epímero biologicamente activa, correspondente ao epímero S de AdoMet, a partir do epímero inactivo é muitas vezes difícil de alcançar. Assim, as concentrações são cofactortipicamente dada por uma mistura de isómeros. Duplos análogos cofactor activados são bastante instável à temperatura ambiente e deve ser armazenado a -20 ° C. Certifique-se também para descongelar as soluções estoque em gelo e mantê-los frio durante a pipetagem. Eles podem ser congelados novamente, mas para garantir a atividade reprodutível nós recomendamos que faça alíquotas.
MTase Proteína: Para transformações com os cofactores activados duplas MTases podem ser utilizados em quantidades catalíticas. No entanto, são muitas vezes MTases enzimas lentos com números de volume de negócios na faixa de -1 min com o AdoMet cofator natural. Por razões de ordem prática, muitas vezes, usar os MTases em quantidades estequiométricas e minimizar o tempo de incubação e temperatura (tipicamente 10 minutos a 2 horas e 20 ° C a 37 ° C). O controlo "cofactor" varia, dependendo do tipo de grupo repórter e detecção. Para a marcação de biotina MTase é simplesmente omitida e análise pode ser feito por transferência de Western (Figura 5B (Figura 5A). No entanto, se a precipitação de histona H3 leva à perda de proteína, SDS-PAGE pode ser estendido e excesso de livre fluorophore TAMRA vai ficar sem o gel com azul de bromofenol frente.
Tampão de modificação: O tampão de enzima óptimo pode ser usado, mas tióis, como o ditiotreitol (DTT) e β-mercaptoetanol, deve ser evitada. Eles se ligam a íons de cobre e b bloquear o seguinte clique reação CuAAC.
CuAAC clique reacção: A concentração final de TAMRA azida deve ser duas vezes tão elevada como a concentração alcino. Quando se utilizam extractos biológicos a concentração de cobre e o ligando deve ser aumentada até 5 mM cada. TAMRA azida é melhor do que solúvel em DMSO em água. Certifique-se de que a concentração final de DMSO é inferior a 12%. Tempos de incubação estendidos podem conduzir a danos e manchas de proteínas no gel de poliacrilamida SDS. Assim, a reacção de marcação deve ser interrompido ou por precipitação da proteína ou adição de tióis.
Este procedimento de marcação de dois passos também pode ser usado para marcar substratos de proteína MTAse ou com biotina para a detecção de Western blot (Figura 5B) ou isolamento com esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Além disso, análogos de AdoMet duplos activados podem ser utilizados para marcar o DNA, RNA e pequenos produtos naturais com MTases correspondentes.
ve_content "> Em comparação com a maioria dos outros métodos de rotulagem dos ácidos nucléicos e proteínas, rotulagem MTase mediada tem a vantagem de substratos nativas podem ser usadas diretamente e nenhuma outra modificação é necessária. É claro, os cuidados devem ser tomados para que os substratos naturais não estão bloqueadas por metilação por meio de uma MTase correspondente in vivo. Além disso, a rotulagem MTase mediada é muito flexível, tanto em termos de grupos repórter, que incluem biotina, fluoróforos ou outras caudas moleculares, bem como alvos para MTases. REBASE, uma base de dados de restrição e ADN endonucleases MTases, lista mais de 700 experimentalmente caracterizados MTases ADN com centenas de sequências de reconhecimento diferentes, variando de dois a oito pb 37 e espera-se que mais de 200 MTases diferentes de todos os tipos são produzidos na célula humana 38. Um determinante importante para actividade MTase é se o análogo de AdoMet encaixa no centro activo da enzima. Embora os cofactores apresentados 6Baz e SeAdoYn são projetadas para ter pequenos grupos reativos, alguns MTases não pode aceitar prontamente eles. Nestes casos, os sítios ativos poderia ser ampliada por engenharia de proteínas como tem sido demonstrado por DNA 35, 23 e RNA MTases proteína 25-28 com estericamente mais exigentes duplas análogos AdoMet ativados. Rotulagem específica da sequência de ADN e ARN com análogos de AdoMet é de grande interesse para a genotipagem (mapeamento ADN) 36 e 39 de detecção de metilação, estudos funcionais de DNA / RNA e DNA / RNA-modificando enzimas 15, bem como para (nano) biotecnologia 13, 14 e 19 a entrega de genes. Outros métodos para a rotulagem DNA covalente específica sequência contar com oligodeoxynucleotides sintéticos triplos formando-hélice, ácidos nucleicos peptídicos ou poliamidas hairpin como dispositivos de segmentação ou em seqüência endonucleases nicking específicos (NEases) seguido de rotulagem tradução nick.
Rotulagem específica de proteínas com duplas análogos AdoMet ativados foi essencialmente direccionado para aplicações em pesquisa proteômica, por exemplo, identificação de novos substratos para MTases proteína em misturas biológicas complexas 27,28, mas outras aplicações, como estudos funcionais, também deve ser viável. Embora a rotulagem MTase mediada tem sido realizado principalmente com MTases purificadas in vitro, marcação também pode ser conseguida em células vivas, como foi relatado recentemente 40. É claro que muitos outros métodos para marcação de proteínas específicas estão disponíveis 3,4. Além de incorporação de aminoácidos não naturais utilizando células manipuladas eles requerem tipicamente fusões genéticas da proteína de interesse com as etiquetas auto-rotulagem / proteins ou tags para a rotulagem mediada por enzimas. A este respeito, as sequências de péptidos curtos que servem como substratos para MTases de proteína, por exemplo, caudas de histona N-terminal, pode ser fundida com uma proteína de interesse e especificamente marcado com análogos da AdoMet e correspondentes MTases proteína.
Finalmente, o repertório biocatalítica de pequenas MTases molécula pode ser expandido com AdoMet sintéticos análogos 41-44. Isto representa uma nova abordagem para introduzir diversidade estrutural em produtos naturais, por exemplo, antibióticos ou polyketides, que devem encontrar aplicações interessantes no rastreamento de atividades biológicas da novela.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
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