DNA og proteiner er sekvens-spesifikt merket med affinitet eller fluorescerende reporter grupper som bruker DNA eller protein metyltransferaser og syntetiske kofaktor analoger. Avhengig av kofaktor spesifisiteten av enzymer, aziridin eller dobbelt aktiverte kofaktor-analoger anvendes for en- eller to-trinns merking.
S -Adenosyl-L-methionin (AdoMet) -avhengige eller SAM metyltransferaser (MTAse) katalyserer overføringen av den aktiverte metylgruppen fra AdoMet til bestemte stillinger i DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler. Denne naturlige metyleringen kan utvides til et bredt utvalg av alkyleringsreaksjoner ved bruk av syntetiske analoger kofaktor. Utskifting av den reaktive sulfonium sentrum av AdoMet med et aziridin ringen fører til kofaktorer som kan kobles sammen med DNA ved hjelp av forskjellige DNA MTases. Disse azidirin kofaktorer kan utstyres med reporter grupper på forskjellige posisjoner på adeninenheten og brukes for S equence spesifikke M ethyltransferase- jeg nduced L abel ing av DNA (smilende DNA). Som et typisk eksempel gir vi en protokoll for biotinylering av pBR322 plasmid DNA i 5'-ATCG A-T-3 'sekvensen med DNA MTAse M.BseCI og aziridinet kofaktor i 6BAzett trinn. Forlengelse av den aktiverte metylgruppe med umettede alkylgrupper resulterer i en annen klasse av AdoMet-analoger som brukes for m ethyltransferase rettet T ransfer av A ctivated G roups (mTAG). Siden de utvidede sidekjeder blir aktivert av sulfonium sentrum og umettet binding, er disse kofaktorer kalles dobbelt-aktiverte AdoMet-analoger. Disse analoger ikke bare fungere som kofaktorer for DNA MTases, som aziridinet kofaktorer, men også for RNA, protein og små molekyl MTases. De blir vanligvis anvendt for enzymatisk modifisering av MTAse-substrater med unike funksjonelle grupper som er markert med rapportørgrupper i en andre kjemisk trinn. Dette er eksemplifisert i en protokoll for fluorescens-merking av histon H3-protein. En liten propargylgruppe overføres fra kofaktor analog SeAdoYn til proteinet av histon H3-lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 etterfulgt av klikk-merking avalkynylated histon H3 med TAMRA azide. MTAse-mediert merking med kofaktor analoger er en slik teknologi for mange spennende bruksområder, inkludert identifisering og funksjonell studie av MTAse underlag samt DNA genotyping og metylering deteksjon.
Særlig merking av nukleinsyrer 1,2 og proteiner 3,4 er av stor interesse for funksjonelle karakteristikker, medisinsk diagnose og (nano) bioteknologi. Her presenterer vi en enzymatisk merking metode for disse biopolymerer som er basert på S -adenosyl-l-metionin (AdoMet eller SAM) -avhengige metyltransferaser (MTases). Denne klassen av enzymer (EC 2.1.1.) Er rettet mot individuelle nukleofile posisjoner (nitrogen, oksygen, svovel og karbonatomer) innenfor bestemte rester av nukleinsyrer og proteiner og naturlig overfører den aktiverte metylgruppe av kofaktor AdoMet (figur 1A) 5. I tillegg kan MTases utnytte syntetiske kofaktor analoger til spesifikk merking med affinitet koder, fluoroforene eller andre etiketter (Figur 1b) 6. To klasser av AdoMet analoger har blitt utviklet: Aziridine kofaktorer for S equence spesifikke M ethyltransferase- jeg </strong> Nduced L abel ing (smilende) 7 og doble aktivert AdoMet analoger til m ethyltransferase styrt T ransfer av A ctivated G roups (mTAG) 8.
Figur 1: reaksjoner katalysert av metyltransferaser (MTases) A. Metyl-gruppen overføring fra den naturlige kofaktor AdoMet (SAM) til forskjellige substrater, inkludert DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler B. Merking / funksjonalisering av nukleinsyrer og proteiner (NNNNN =.. basepar av DNA-nukleotider, for RNA- og aminosyrer til proteiner; XXXXX = gjenkjennelsessekvensen av MTAse med target rest i grønt) med syntetiske analoger kofaktor. Azidirin kofaktorer som inneholder en reporter gruppe (blå sfære)festet til adenin-ringen er sekvensen spesielt kombinert med målet residuet (til venstre) og dobbelt-aktivert AdoMet analoger fører til overføring av lengre alkylkjeder som bærer en kjemisk reporter Y (til høyre), som kan merkes ved å bioorthogonal klikk reaksjon i et annet trinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Azidirin kofaktorer fungerer best med DNA MTases. De inneholder en tre-leddet ring med et nitrogenatom 9 (eller et N -mustard 10,11) i stedet for sulfonium senter som reaktiv gruppe. Protonering av dette nitrogenatom aktiverer Åziridinringen for nukleofilt angrep av target-nukleotid som fører til kovalent kobling av hele kofaktor med DNA. Ved å feste rapportørgrupper til adenin ringen aziridinet kofaktorer kan brukes i kombinasjon med DNA-MTases å merke DNA i ett trinn ( <stron g> Figur 1B, venstre) 7,12. Dette er vist i detalj for biotinylering av DNA med 6BAz 13-15 (aziridin kofaktor med biotin festet til 6 stillingen av adenin-ring) og adenin-spesifikk DNA MTAse fra Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (figur 2, se protokoll seksjon 2: Ett-trinns merking av DNA via azidirin kofaktorer). I tillegg til M.BseCI (5'-ATCG A-T-3 'gjenkjenningssekvens), DNA MTases fra Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3'), fra Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 '-G C GC-3') og fra Spiroplasma (M.SssI, 5'-G C-3 ") har blitt brukt til å biotinylere DNA med 6BAz 17. Videre kan azidirin kofaktorer være ansatt for ett-trinns fluorescens DNA merking 18,19.
ontent "fo: keep-together.within-side =" always ">Doble aktivert AdoMet analoger inneholder utvidet umettede sidekjeder i stedet for en metylgruppe på sulfonium sentrum (Figur 1B </strong>, høyre) 20. Den umettede dobbelt- eller trippelbinding i β-stilling til sulfonium midt elektronisk kompenserer ugunstige steriske effekter i overgangstilstanden ved konjugativt stabilisering. Siden både sulfonium sentrum og umettet binding aktivere sidekjeden for enzymatisk overføring, ble disse kofaktorer heter dobbel-aktiverte AdoMet analoger. Vanligvis blir de brukt til å overføre sidekjeder med unike kjemiske grupper (kjemiske journalister), som amino, alkyn og azid grupper, for chemo-selektiv merking i et andre trinn 8,21. Generelt, dobbel-aktivert AdoMet analoger kan ikke bare fungere som kofaktorer for DNA MTases 8,20,21 men også for RNA MTases 22,23 og protein MTases 24-28 tillater ytterligere merking av RNA og proteiner. Men de utvidede sidekjedene er sterisk mer krevende enn en metylgruppe og utvide den MTAse aktive områder ved protein engineering er oftno nødvendig for å oppnå effektiv overføringshastigheter. En annen løsning på dette problemet er å bruke en AdoMet analog med en liten propargylgruppe (tre karboner), hvor terminalen alkyn tjener to funksjoner: 1. Stabilisering av overgangstilstanden ved enzymatisk overføring og 2. reaktiv håndtak for følgende kjemiske modifiseringer av kobber katalysert azid-alkyn cykloaddisjon (CuAAC) klikk kjemi. Det viste seg at den resulterende propargylalkoholer AdoMet analog 29 er ganske ustabil under nøytrale eller svakt basiske betingelser, og kun av begrenset nytte. Denne ulempen kan bli løst ved å erstatte svovelatomet med selen. Den resulterende kofaktor 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-karboksypropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoksyadenosin (SeAdoYn, figur 3) er akseptert av villtype DNA, RNA og protein MTases 30-32 som opphever behovet for protein engineering i mange tilfeller. Dette eksemplifiseres ved fluorescens pro tein merking med histon H3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 33 (figur 3, se protokoll seksjon 3: To-trinns protein merking via doble aktiverte kofaktorer).
Fig. 3: Sekvens-spesifikke to-trinns fluorescens-merking av histon H3 med Set7 / 9, SeAdoYn og TAMRA azid Proteinet MTAse Set7 / 9 naturlig methylates aminogruppen av lysin 4 i histon H3 (H3K4, grønn) ved hjelp av AdoMet. Med den dobbeltaktiverte kofaktor SeAdoYn den MTAse overfører en liten propargylgruppe (rød) til lysinresten. Vedlagte terminal trippelbinding er så selektivt modifiseres i en bioorthogonal klikk reaksjon (kobber-katalysert azid-alkyn cykloaddisjon, CuAAC) med azid-avledede TAMRA (tetramethylrhodamine, blå) fluorophore.belastning / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ett-trinns merking av DNA med DNA MTases og azidirin kofaktorer (smilende DNA) er en robust metode, men noen aspekter bør vurderes når du planlegger forsøket.
Aziridine kofaktor: The 6BAz konsentrasjon for DNA merking med M.BseCI var 60 mikrometer. Ved bruk av andre DNA MTases kofaktor konsentrasjonen skal være optimalisert, f.eks konsentrasjoner så lavt som 20 mikrometer har vært ansatt med DNA MTAse M.TaqI 19. Lave konsentrasjoner 6BAz har den fordel at e…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
Boric acid | Gerbu | 1115 | |
Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
MOPS | Gerbu | 1081 | |
Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
TAMRA-azide | |||
TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |