Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos
Summary
ADN y las proteínas se marcan secuencia específicamente con afinidad o grupos indicadores fluorescentes usando ADN o de proteínas metiltransferasas y análogos sintéticos de cofactor. Dependiendo de la especificidad de cofactor de las enzimas, aziridina o dobles análogos de cofactores activados se emplean para el etiquetado de uno o dos pasos.
Abstract
S -Adenosyl-L-metionina (AdoMet o SAM) metiltransferasas dependientes (MTase) catalizan la transferencia del grupo metilo activado a partir de AdoMet a posiciones específicas en el ADN, ARN, proteínas y pequeñas biomoléculas. Esta reacción de metilación natural puede ampliarse a una amplia variedad de reacciones de alquilación utilizando análogos cofactor sintéticos. La sustitución del centro de sulfonio reactiva de AdoMet con un anillo de aziridina conduce a cofactores que se pueden acoplar con el ADN por varios MTases de ADN. Estos cofactores de aziridina pueden ser equipados con grupos informadores en diferentes posiciones del resto de adenina y se utilizan para S-equence específica M ethyltransferase- I nduced L Abel ING de ADN (DNA sonriendo). Como un ejemplo típico damos un protocolo para la biotinilación de ADN del plásmido pBR322 en la secuencia 5'-ATCG A T-3 'con el MTase M.BseCI ADN y el cofactor aziridina en 6BAzun solo paso. Extensión del grupo metilo activado con grupos alquilo insaturados resultados en otra clase de análogos de AdoMet que se utilizan para m ethyltransferase dirigida TRANSFERENCIA DE UN ctivated rupos G (MTag). Dado que las cadenas laterales largos son activados por el centro de sulfonio y el enlace insaturado, estos cofactores son llamados análogos de AdoMet doble activadas. Estos análogos no sólo funcionan como cofactores para MTases de ADN, como los cofactores de aziridina, sino también para el ARN, proteínas y pequeños MTases molécula. Se utilizan típicamente para la modificación enzimática de sustratos MTase con grupos funcionales únicos que se etiquetan con grupos informadores en una segunda etapa química. Esto se ejemplifica en un protocolo para el marcaje de fluorescencia de la proteína histona H3. Un grupo propargilo pequeña se transfiere desde el SeAdoYn análogo cofactor de la proteína por la histona H3 lisina 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 seguido por clic etiquetado de lahistona H3 alkynylated con TAMRA azida. Etiquetado mediada MTase con análogos cofactor es una tecnología que permite muchas aplicaciones interesantes, como la identificación y el estudio funcional de sustratos MTase así como el genotipado de ADN y detección de metilación.
Introduction
Un etiquetado específico de los ácidos nucleicos y proteínas 1,2 3,4 es de gran interés para las caracterizaciones funcionales, diagnóstico médico y (nano) biotecnología. Aquí presentamos un método de marcaje enzimático para estos biopolímeros que se basa en S -adenosyl-l-metionina (AdoMet o SAM) metiltransferasas dependientes (MTases). Esta clase de enzimas (EC 2.1.1.) Se dirige a posiciones individuales nucleófilos (nitrógeno, oxígeno, azufre y átomos de carbono) dentro de los residuos específicos de ácidos nucleicos y proteínas y, naturalmente, transfiere el grupo metilo activado de la AdoMet cofactor (Figura 1A) 5. Además, MTases pueden utilizar análogos sintéticos cofactor para el etiquetado específico con etiquetas de afinidad, fluoróforos u otras etiquetas (Figura 1B) 6. Dos clases de análogos de AdoMet se han desarrollado: cofactores aziridina para concreto-equence S M ethyltransferase- I </strong> Nduced L abel ing (sonriendo) 7 y dobles activados análogos AdoMet para m ethyltransferase dirigida TRANSFERENCIA DE UN ctivated rupos G (MTag) 8.
Figura 1: reacciones catalizadas por metiltransferasas (MTases) A. Metil transferencia de grupo desde el cofactor natural de AdoMet (SAM) a diversos sustratos incluyendo ADN, ARN, proteínas y pequeñas biomoléculas B. Etiquetado / funcionalización de los ácidos nucleicos y proteínas (NNNNN =.. pares de bases de ADN, nucleótidos de ARN para ácidos y aminoácidos para las proteínas; XXXXX = secuencia de reconocimiento de la MTase con objetivo de residuos en verde) con análogos de cofactor sintéticos. Cofactores aziridina contienen un grupo indicador (azul esfera)unido al anillo de adenina son secuencia junto específicamente con el objetivo de residuos (izquierda) y de doble activado análogos de AdoMet llevar a la transferencia de cadenas de alquilo extendidos que llevan un reportero química Y (derecha) que puede ser etiquetado por reacción bioorthogonal clic en un segundo paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Cofactores aziridina funcionan mejor con ADN MTases. Contienen un anillo de tres miembros con un átomo de nitrógeno 9 (o un N de mostaza 10,11) en lugar del centro de sulfonio como grupo reactivo. La protonación de este átomo de nitrógeno activa el anillo de aziridina para el ataque nucleofílico por el nucleótido diana que conduce a Acoplamiento covalente de todo el cofactor con el ADN. Al conectar grupos informadores al anillo de adenina los cofactores de aziridina se pueden utilizar en combinación con ADN MTases para etiquetar ADN en un solo paso ( <stron g> Figura 1B, izquierda) 7,12. Esto se demuestra en detalle para la biotinilación de ADN con 6BAz 13-15 (cofactor de aziridina con biotina unido a la posición 6 del anillo de adenina) y la adenina específica de ADN MTase de Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (Figura 2, véase la sección 2 del protocolo: un solo paso etiquetado de ADN a través de aziridina cofactores). Además de M.BseCI ('secuencia de reconocimiento, la MTases ADN de Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3 5'-ATCG A T-3)'), a partir de Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 '-G C GC-3') y desde Spiroplasma (M.SssI, 5'-C G-3 ') se han utilizado con éxito para biotinilar ADN con 6BAz 17. Además, cofactores de aziridina pueden emplearse para un solo paso de fluorescencia de ADN etiquetado 18,19.
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Figura 2:. Biotinilación específica de secuencia de un solo paso de ADN con M.BseCI y 6BAz El ADN MTase M.BseCI reconoce la secuencia de doble cadena de ADN 5'-ATCG A T-3 'y, naturalmente, metila el grupo amino de la segunda adenina residuo (verde) usando AdoMet. Con el cofactor aziridínico 6BAz el curso de la reacción se cambia y M.BseCI conduce a la secuencia de ADN específica biotinylation acoplando todo el cofactor incluyendo biotina (azul) con la adenina objetivo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Doble análogos de AdoMet activados contienen extendieron cadenas laterales insaturadas en lugar de un grupo metilo en el centro de sulfonio (Figura 1B </strong>, derecha) 20. El doble o triple enlace insaturado en β-posición al centro de sulfonio compensa electrónicamente efectos estéricos desfavorables en el estado de transición de la estabilización conjugativo. Dado que tanto el centro de sulfonio y el enlace insaturado activan la cadena lateral para la transferencia enzimática, estos cofactores fueron nombrados análogos AdoMet doble activados. Típicamente, se utilizan para transferir cadenas laterales con grupos únicos químicos (reporteros químicos), como los grupos amino, alquino y azida, para el etiquetado quimioselectivo en un segundo paso 8,21. En general, de doble activado análogos AdoMet puede no sólo funcionan como cofactores de ADN MTases 8,20,21 sino también para ARN MTases 22,23 y MTases proteínas 24-28 permitiendo etiquetado adicional de ARN y proteínas. Sin embargo, las cadenas laterales largos son estéricamente más exigente que un grupo metilo y ampliando las MTase sitios activos de proteínas de ingeniería es oftes necesario para obtener las velocidades de transferencia eficientes. Otra solución a este problema es utilizar un análogo AdoMet con un grupo pequeño de propargilo (tres carbonos) donde el alquino terminal sirve para dos funciones: 1. estabilización del estado de transición durante la transferencia enzimática y 2. mango reactiva para el seguimiento de las modificaciones químicas de cobre catalizada cicloadición-azida alquino (CuAAC) haga clic en la química. Resultó que la propargílico resultante AdoMet analógico 29 es bastante inestable en condiciones neutras o ligeramente básicas y sólo de uso limitado. Este inconveniente se puede solucionar mediante la sustitución del átomo de azufre con el selenio. El cofactor resultante 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-carboxipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-desoxiadenosina (SeAdoYn, Figura 3) que es aceptado por el ADN de tipo salvaje, el ARN y MTases proteína 30-32 que abroga la necesidad de la ingeniería de proteínas en muchos casos. Esto se ejemplifica por fluorescencia pro etiquetado proteína con la histona H3 lisina 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Figura 3, véase la sección 3 del protocolo: el etiquetado de proteínas en dos pasos a través de cofactores dobles activados).
Figura 3:. De dos pasos de fluorescencia etiquetado específico de secuencia de la histona H3 con Set7 / 9, SeAdoYn y TAMRA azida La proteína MTase Set7 / 9 metila naturalmente el grupo amino de la lisina 4 en la histona H3 (H3K4, verde) usando AdoMet. Con el cofactor de doble activado SeAdoYn la MTase transfiere un grupo propargilo pequeña (rojo) al residuo de lisina. El triple enlace terminal conectado es luego modificado selectivamente en un clic reacción bioorthogonal (azida alquino cicloadición catalizada por cobre, CuAAC) con (tetrametilrodamina, azul) fluoróforo azida derivatizado TAMRA.carga / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un paso etiquetado de ADN con MTases ADN y cofactores aziridina (ADN sonriendo) es un método robusto pero algunos aspectos se debe considerar al planear el experimento.
Cofactor Aziridine: La concentración 6BAz para el etiquetado de ADN con M.BseCI fue de 60 mM. Cuando se utilizan otros MTases la concentración de ADN cofactor debe optimizarse, por ejemplo, concentraciones tan bajas como 20 mM han sido empleados con el ADN MTase M.TaqI 19. Las bajas concentraci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
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