Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов
Summary
ДНК и белки-последовательность специально помечены близости или люминесцентных репортер групп с использованием ДНК или белка-метилтрансферазы и синтетические аналоги кофактора. В зависимости от кофактора специфики ферментов, азиридина или двойных активированных аналогов кофактора используются для одно- или двухступенчатой маркировки.
Abstract
S -Adenosyl-L-метионин (AdoMet или SAM) зависимых метилтрансферазы (МТАазе) катализируют перенос активированного метильной группы от AdoMet к отдельным позициям в ДНК, РНК, белков и малых биомолекул. Это естественная реакция метилирования может быть расширена до широкого спектра реакций алкилирования с использованием синтетических аналогов кофактора. Замена реактивной сульфониевой центре AdoMet с Азиридиновое кольцо приводит к кофакторов, которые могут быть в сочетании с различными ДНК MTases ДНК. Эти кофакторы азиридиновые может быть оснащен репортерных групп в различных положениях аденина и используется для S equence конкретных М ethyltransferase- Я nduced л Abel Ing ДНК (ДНК улыбается). В качестве типичного примера приведем протокол для биотинилирования pBR322 плазмиды ДНК в последовательности 5'-ATCG Т-3 "с ДНК МТАазе M.BseCI и азиридинового кофактора 6BAz водин шаг. Расширение активированного метильной группы с ненасыщенных алкильных групп приводит к другому классу AdoMet аналогов, которые используются для м ethyltransferase-направленный Т ransfer Л ctivated G roups (MTAG). Поскольку расширенные боковые цепи активируются сульфониевой центра и ненасыщенной связи, эти кофакторы называются дважды активированные аналоги AdoMet. Эти аналоги не только в качестве кофакторов ДНК MTases, как азиридиновых кофакторов, но и для РНК, белков и малых MTases молекулы. Они обычно используются для модификации ферментативной МТАазы субстратов с уникальными функциональными группами, которые меченных репортерных групп во втором химическом этапе. Это видно на примере протокола для флуоресценции маркировки гистона H3 белка. Небольшой пропаргил группы передается от аналогового кофактором SeAdoYn с белком в гистона Н3 лизина 4 (H3K4) МТАазы Set7 / 9 с последующим щелчком маркировкиalkynylated гистонов H3 с TAMRA азида. МТАазе-опосредованной маркировки с кофактора аналогов технологией для многих интересных приложений, включая идентификацию и функциональный изучения МТАазе субстратов, а также генотипирования ДНК и обнаружения метилирования.
Introduction
Удельный маркировка нуклеиновых кислот 1,2 и белков 3,4 представляет большой интерес для функциональных характеристик, медицинской диагностики и (нано) биотехнологии. Здесь мы представляем ферментативного метода маркировки для этих биополимеров, который основан на S -adenosyl-L-метионина (AdoMet или SAM) -зависимых метилтрансфераз (MTases). Этот класс ферментов (EC 2.1.1.) Цели отдельных нуклеофильные позиции (азот, кислород, сера и атомами углерода) в пределах конкретных остатков нуклеиновых кислот и белков, и, естественно, передает активированного метильной группы кофактора AdoMet (1А) 5. Кроме того, MTases могут использовать синтетические аналоги кофактором для конкретного маркировки со сродством теги, флуорофорами или других меток (рис 1б) 6. Два класса AdoMet аналогов были разработаны: Азиридин кофакторов для S equence специфической M ethyltransferase- I </strong> Nduced L Абель Инг (улыбается) 7 и двухместные активированные аналоги AdoMet для м ethyltransferase-направленного T ransfer Л ctivated G roups (Мечел Трейдинг АГ) 8.
Рисунок 1: реакций, катализируемых метилтрансфераз (MTases) Групповой трансфер А. Метил из природного кофактора AdoMet (SAM) на различных подложках, включая ДНК, РНК, белков и малых биомолекул Б. Маркировка / функционализации нуклеиновых кислот и белков (NNNNN =.. пар оснований для ДНК, нуклеотиды РНК и аминокислот для белков; XXXXX = последовательность признание МТАазе с целевой остатка в зеленый) с синтетическими аналогами кофактора. Азиридин кофакторов содержащие репортер группу (синий шар)прикреплен к аденин кольце последовательность специально в сочетании с целевой остаток (слева) и дважды активируется аналогов AdoMet привести к передаче расширенных алкильных цепей, несущих Chemical Reporter Y (справа), которые могут быть помечены bioorthogonal реакции мыши на втором этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Азиридин алгебраические лучше всего работают с ДНК MTases. Они содержат трехчленное кольцо с атомом азота 9 (или N -mustard 10,11) вместо сульфониевого центра, реактивная группа. Протонирование этого атома азота активирует Азиридиновое кольцо для нуклеофильной атаки по целевой нуклеотид, что приводит к ковалентного связывания всей кофактора с ДНК. Присоединив репортерных групп в кольце аденин азиридиновые кофакторы могут быть использованы в сочетании с ДНК MTases маркировать ДНК в одну стадию ( <stron г> Рисунок 1B, слева) 7,12. Это показано более подробно на биотинилирования ДНК с 6BAz 13 – 15 (азиридинового кофактора с биотином, прикрепленной к 6 положении кольца аденина) и аденин-специфической ДНК МТАазы из Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (фиг.2, смотрите раздел протокола 2: один шаг маркировки ДНК с помощью азиридиновых кофакторов). В дополнение к M.BseCI ('Sequence признание, ДНК MTases из Thermus адиайсиз (M.TaqI, 5'-TCG -3 5'-ATCG Т-3)'), из Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 '-g C GC-3') и от Spiroplasma (M.SssI, 5'-C G-3 ') были успешно использованы для biotinylate ДНК с 6BAz 17. Кроме того, азиридиновые кофакторы могут быть использованы для одностадийного маркировки флуоресценции ДНК 18,19.
ontent "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда ">
Рисунок 2:. Последовательность, специфичную один шаг биотинилирование ДНК с M.BseCI и 6BAz ДНК МТАазы M.BseCI распознает последовательность двухцепочечной ДНК 5'-ATCG Т-3 'и, естественно, метилирует аминогруппы второй аденина Остаток (зеленый) с помощью AdoMet. С азиридинового кофактора 6BAz ходом реакции изменяется и M.BseCI приводит к последовательностью, специфичной биотинилирование ДНК путем связывания всю кофактор в том числе биотин (синий) с целевой аденина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Двойные активированные аналоги AdoMet содержат расширенные ненасыщенные боковые цепи вместо метильной группы в сульфониевого центра (рисунок 1b </stronг>, справа) 20. Ненасыщенные двойную или тройную связь в β-положении к сульфониевых центра компенсирует неблагоприятные стерических эффектов в переходном состоянии от конъюгативного стабилизации. Так как сульфоний центр и ненасыщенные связи активировать боковую цепь для ферментативного переноса, эти алгебраические были названы дважды активированные аналоги AdoMet. Как правило, они используются для передачи боковые цепи с уникальными химических групп (химические репортеров), как и аминокислоты, алкинов и азид групп, для химико-селективный маркировки на втором этапе 8,21. В общем, двойные активированные аналоги AdoMet не может работать только в качестве кофакторов ДНК MTases 8,20,21, но и для РНК MTases 22,23 и белковых MTases 24 – 28 позволяет дополнительно маркировки РНК и белков. Тем не менее, расширенные боковые цепи являются стерически более жесткими, чем метильной группой и расширение МТАазы активные участки от белка инженерии частоан требуется для получения эффективных скорости передачи. Другое решение этой проблемы состоит в использовании аналога AdoMet с небольшим пропаргил группы (три атомов углерода), где терминал алкина выполняет две функции: 1. стабилизации переходного состояния во время передачи ферментативной и реактивной 2. ручкой для следующей химической модификации от медью катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) нажмите химию. Выяснилось, что в результате пропаргиловой AdoMet аналог 29 является довольно нестабильны в нейтральной или слегка щелочной среде, и только ограниченное применение. Этот недостаток можно исправить, заменив атом серы с селеном. Полученный кофактором 5 '- [(Se) [(3S) -3-амино-3-карбоксипропил] проп-2-ynylselenonio] -5'-дезоксиаденозин (SeAdoYn, рисунок 3) принимается дикого типа ДНК, РНК, и белковые MTases 30 – 32, которые отменяют необходимость белковой инженерии во многих случаях. Это подтверждается флуоресценции про белок маркировка с гистона H3 лизина 4 (H3K4) МТАазе Set7 / 9 33 (рис 3, смотрите раздел протокола 3: маркировка двухступенчатой белка, с помощью двойного активированных кофакторов).
Рисунок 3:. Последовательность конкретных двухступенчатый флуоресценции маркировки гистона Н3 с Set7 / 9, SeAdoYn и TAMRA азид белок МТАазы Set7 / 9, естественно метилирует аминогруппы лизина 4 в гистона Н3 (H3K4, зеленый), используя AdoMet. С двойной активирована кофактора SeAdoYn МТАазы передает небольшой пропаргил группу (красный) до остатка лизина. Прилагается терминал тройная связь выборочно модифицировать в bioorthogonal реакции мыши (медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения, CuAAC) азидной-производные TAMRA (тетраметилродамин, синий) флюорофора.нагрузка / 52014 / 52014fig3highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Один шаг маркировки ДНК с MTases ДНК и азиридиновых кофакторов (улыбается ДНК) является надежным методом, но некоторые аспекты следует учитывать при планировании эксперимента.
Азиридин кофактором: концентрация 6BAz для маркировки ДНК с M.BseCI был 60 мкм. При использовании ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
- Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -. W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -. W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. , (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -. G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -. P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
