Summary
DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.
Abstract
S -Adenosyl -1- 메티오닌 (SAM 또는 AdoMet) 의존성 methyltransferases (MTase)는 DNA, RNA, 단백질, 및 작은 생체의 특정 위치들에서 활성화 AdoMet 메틸기의 전달을 촉매. 이것은 천연 메틸화 반응은 보조 인자 합성 유사체를 사용하여 알킬화 반응의 다양한 확장 될 수있다. 아지리 링 AdoMet의 반응 설 포늄 센터의 교체는 다양한 DNA의 MTases에 의해 DNA와 결합 될 수있다 보조 인자로 연결됩니다. 이 아지리 공동 인자는 아데닌 부분의 다른 위치에서 기자 그룹 장착 내가 DNA (미소 DNA)의 L의 아벨 보내고을 nduced ethyltransferase- S의 equence 별 M 사용할 수 있습니다. 전형적인 예로서 우리는 DNA MTase M.BseCI 및 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz에서와 5'-ATCG T-3 '순서에서 나 pBR322 플라스미드 DNA의 바이오 틸위한 프로토콜을 제공한 단계. ctivated G의 roups (MTAG)의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer에 사용되는 AdoMet 유사체의 또 다른 클래스의 불포화 알킬 그룹 결과와 활성화 된 메틸 그룹의 확장. 확장 측쇄가 설 포늄 센터와 불포화 결합에 의해 활성화되기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 불린다. 이러한 유사 아지리 딘 보조 인자 같은 DNA MTases에 대한 보조 인자로서 기능뿐만 아니라, RNA, 단백질과 작은 분자 MTases에 대한뿐만 아닙니다. 그들은 일반적으로 초 화학 공정에서 리포터기로 표지 유니크 작용기 MTase 기판의 효소 적 변형을 위해 사용된다. 이것은 히스톤 H3 단백질의 형광 표지 용 프로토콜에 예시된다. 작은 프로 파질 그룹의 클릭 표시 다음에 히스톤 H3 라이신 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 단백질에 보조 인자 (cofactor) 아날로그 SeAdoYn에서 전송TAMRA 아 지드와 alkynylated 히스톤 H3. 보조 인자 (cofactor) 유사체와 MTase 매개 라벨은 식별 및 기능 연구 MTase 기판뿐만 아니라 DNA 유전자형과 메틸화 검출을 포함하여 많은 흥미로운 응용 프로그램을위한 실현 가능한 기술을 제공한다.
Introduction
핵산 1, 2, 3, 4 단백질의 특정 라벨링 기능 특성화, 의료 진단 및 (나노) 생명 공학에 대한 주요 관심의 대상이다. 여기에서 우리는 S의 -adenosyl -1- 메티오닌 (AdoMet 또는 SAM) 의존성 methyltransferases (MTases)를 기반으로 이러한 바이오 폴리머에 대한 효소 라벨링 방법을 제시한다. 효소의이 클래스 (EC 2.1.1.) 핵산 및 단백질의 특정 잔기 내의 개별 핵성 위치 (질소, 산소, 황 및 탄소 원자)를 대상으로 자연스럽게 팩터 AdoMet (도 1a) (5)의 활성화 메틸기를 전송한다. 또한, MTases 선호도 태그, 형광 또는 다른 라벨 (그림 1B) 6 특정 라벨링 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 이용할 수있다. AdoMet 유사체의 두 클래스는 개발되어 있습니다 : S의 equence 별 M의 ethyltransferase-의 I에 대한 아지리 딘 보조 인자를 L의 아벨 보내고 (미소) 7 ctivated G의 roups의 m의 ethyltransferase 지시 T의를 ransfer 더블 활성화 AdoMet 유사체 (MTAG) 8.
그림 1 :.. methyltransferases (MTases) DNA, RNA, 단백질과 작은 생체 분자 등 다양한 기판에 자연 보조 인자 (cofactor) AdoMet (SAM)에서 A. 메틸 그룹 전송 핵산과 단백질의 B. 레이블 / 기능화 (NNNNN = 의해 촉매 반응 단백질 RNA와 아미노산에 대한 기본 DNA에 대한 쌍, 뉴클레오티드, 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체와 녹색에서 대상 잔류 물)와 MTase의 XXXXX = 인식 서열. 리포터기를 함유 아지리 보조 인자 (파란색 영역)특히 대상 잔류 물 (왼쪽)와 더블 활성화 AdoMet 유사체와 결합 순서가 아데닌 링의 첨부하면 두 번째 단계에서 bioorthogonal 클릭 반응에 의해 표시 될 수있는 화학 기자 Y (오른쪽)를 운반하는 확장 알킬 체인 전송에지도한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아지리 딘 보조 인자는 DNA MTases 가장 잘 작동합니다. 그들은 질소 원자 (9) (또는 N은 10, 11를 - 겨자) 대신 술 포늄 센터 반응성 그룹과 세 개의 원 고리가 포함되어 있습니다. 이 질소 원자의 양성자는 DNA와 전체 공동 인자의 결합을 공유 결합에 이르게 대상 염기에 의한 친 핵성 공격에 대한 아지리 딘 링을 활성화합니다. 아데닌 고리에 리포터 그룹을 부착함으로써 아지리 딘는 보조 인자 (하나의 단계로 DNA를 DNA MTases 라벨과 조합하여 사용될 수있다
그림 2. M.BseCI 및 6BAz와 DNA의 서열 특이 한 단계 바이오 틸은 DNA MTase M.BseCI는 이중 가닥 DNA 서열 5'-ATCG T-3 '을 인식하여 자연 번째의 아데닌 아미노기의 메틸 잔류 물 (녹색) AdoMet를 사용하여. 아지리 딘 보조 인자 (cofactor) 6BAz으로 반응 과정이 변경되고 M.BseCI 대상 아데닌과 비오틴 (파란색)를 포함하여 전체 보조 인자 (cofactor)를 결합하여 특정 DNA의 바이오 틸을 시퀀스 리드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
더블 활성화 AdoMet 유사체 불포화 측쇄 대신 술포 센터 메틸기 (도 1b 연장 포함 20. 술 포늄 센터 β-위치에 불포화 이중 또는 삼중 결합은 전자 공역 안정화에 의한 전이 상태 내에서 불리한 입체 효과를 보상한다. 술포 센터와 불포화 결합 모두 효소 전송 측쇄를 활성화하기 때문에, 이러한 보조 인자들은 이중 - 활성화 AdoMet 유사체 뽑혔다. 통상적으로, 이들은 제 2 단계에서 화학 - 8,21 선택적 레이블링, 아미노, 알킨 아 지드 기 등의 고유의 화학 그룹 (화학 기자)로 측쇄를 전송하는 데 사용된다. RNA와 단백질의 추가 표시를 허용 (28) - 일반적으로 두 번 활성화 AdoMet 유사체는 RNA MTases 22, 23 DNA MTases 8,20,21에 대한뿐만 아니라위한 보조 인자와 단백질 MTases 24뿐만 아니라 작동 할 수 있습니다. 그러나, 확장 된 측쇄는 더 입체적 메틸기보다 까다 롭고 엔지니어링 자주 단백질이다 MTase 의해 활성 부위를 확대 아르EN 효율적인 전송 속도를 얻기 위해 필요한. 구리에 의한 화학적 변형을 다음 용 효소 전송 중에 전이 상태 1. 안정화 2. 반응성 핸들이 문제에 대한 또 다른 해결책은 작은 프로 파길 말단 알킨이 두 가지 기능을 제공 기 (세 탄소)와 AdoMet 유사체를 사용하는 촉매 아 지드 - 알킨 고리 (CuAAC) 화학을 클릭합니다. 이 결과 프로 파르 길 AdoMet 아날로그 (29)는 중성 또는 약간 염기성 조건 하에서 만 사용이 제한 상당히 불안정 밝혀졌다. 이러한 결점은 셀레늄 황 원자를 대체하여 고정 될 수있다. 얻어진 보조인 5 '- [(SE) [(3- S) -3- 아미노 -3- 카르복시] 프로 프 -2- ynylselenonio] -5'- 데 옥시 아데노신 (SeAdoYn,도 3) 야생형 DNA에 의해 허용되고, RNA 단백질 MTases 30 - 많은 경우에 단백질 공학에 대한 필요성을 폐지 32. 이것은 형광의 예로는 프로 히스톤 H3 리신과 TEIN 라벨링 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: 더블 활성 보조 인자를 통해 2 단계의 단백질 표지도 3은 프로토콜 부 (3) 참조).
도 3 :. Set7 / 9 히스톤 H3의 서열 - 특이 적 두 단계 형광 라벨링, SeAdoYn 및 TAMRA 아 지드 단백질 MTase Set7 / 9 자연스럽게 AdoMet를 사용하여 히스톤 H3에 리신 (4)의 아미노기 (H3K4, 녹색)의 메틸. 이중 활성화 보조 인자 (cofactor)로 SeAdoYn MTase은 라이신 잔기에 작은 프로 파길 그룹 (빨간색)를 전송합니다. 첨부 된 단말기 삼중 결합은 선택적으로 아 지드 - 유도 TAMRA (테트라 메틸, 파랑) 형광과 bioorthogonal 클릭 반응 (구리 촉매 아 지드 - 알킨 고리, CuAAC)에서 수정됩니다.로드 / 52014 / 52014fig3highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 일반 지침
- 저장 아지리 공동 인자 (DMSO)에 6BAz 단백질 MTase -80 ° C에서 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 및 DNA MTase M.BseCI -20 ° C에서 (50 % 글리세롤)를 포함하여 다른 모든 시약.
- 탈 이온수에 멸종 계수 ε 269nm (6BAz) = 16,000cm -1 M -1 ε 260 나노 미터 (SeAdoYn) = 15,400cm -1 M -1을 사용하여 UV / 마주 분광법을 통해 6BAz과 SeAdoYn의 농도를 결정합니다. 흡광 계수가 가능한 경우 280 nm에서 흡수를 통해 직접, 브래드 포드 분석으로 MTases의 농도를 결정하거나.
- 효소 활성의 손실을 방지하기 위해 집중적 인 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 기포를 생성하지 않도록하십시오. 대신 부드럽게 피펫 아래로 섞는다.
- DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 분석에서 최종 DMSO 농도가 작다는 것을 확인5 % 이상. 항상 DNA와 비특이적 인 반응을 방지하는 분석 완충액에 10 mM의 마그네슘 이온을 포함한다.
- 산성 원액에서 더블 활성화 공동 인자를 추가 할 때 pH 변화를 방지하고 분석 용액의 pH가 크게 변화하지 않도록 작은 볼륨 (고농축 원액)를 사용합니다. 그들이 필요한 구리 이온의 착물에 의한 클릭 반응을 방해 할 수 있기 때문에 분석 버퍼에 티올, 예를 들면, β-머 캅토 에탄올 또는 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 피하십시오.
아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA 2. 한 단계 라벨링
- 순서 특정 메틸화 된-유도 레이블 ING M.BseCI DNA MTase 및 아지리 공동 인자 6BAz와 플라스미드 DNA의 (미소).
- 20 ° C에서 조효소 용액을 얼음 위에서 해동하고, 반응 혼합물을 준비한다.
- 분석뿐만 아니라 비 특정 수정 및 & #를 시각화, "보조 인자 (cofactor)"제어를 수행8220; 효소 "제어, MTase 준비가 자연 보조 인자 (cofactor)의 AdoMet이 없는지 확인합니다.
- 10 배 변성 버퍼 세이 믹스 2㎕의 옵션 (100 mM 트리스 - 염산을 함유하는 100 mM의의 MgCl 2, 20 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, pH를 7.4) 인 pBR322 (0.5 ㎍ / μL), 10 당량의 2 μL. DNA상의 인식 서열 (나 pBR322 1 인식 서열) 및 20 μL의 총 부피 내 60 μM의 최종 농도 아지리 딘 보조인 6BAz 당 M.BseCI. 보조 인자 및 DNA MTase 마지막에 추가합니다.
참고 : β-메르 캅토 에탄올은 독성, 부식성과 환경 파괴입니다. - "보조 인자 (cofactor)"제어를 위해 대신 6BAz의 탈 이온수를 추가하는 대신 M.BseCI과 "효소"제어를위한 탈 이온수를 추가합니다.
- 부드럽게 위아래로 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
- 1 시간 동안 55 ℃에서 인큐베이션 튜브.
- 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다.
- 제한 - 수정 분석은 DNA 변형을 확인합니다.
- 80 ㎕의 탈 이온수 중 3.3 μL (100 mM의 트리스 -HCl, 50 mM의의 MgCl 2, 1 M의 NaCl, 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민, pH가 8.0을 함유) 10 ㎕를 10 배 R.TaqI 완충액을 혼합하여 용액을 제조 제한 효소 테르 무스 aquaticus에서 (REase) (R.TaqI, 10 U / μL). 마지막 단계에서 REase를 추가해야합니다.
- 2.1.7 각 튜브에 R. TaqI은 버퍼 10 배의 2 μL 이상 (2.2.1)에서 솔루션의 28 μl를 추가합니다.
- 부드럽게 위아래로 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
- 30 분 동안 65 ℃에서 인큐베이션 튜브.
- 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다.
- 스트렙 타비 딘과 전기차 변화 분석 (EMSA)의 기능 변경을 확인합니다.
- 각 튜브 (2.2.5)에서 25 μL를 제거하고 스트렙 트 아비딘 m에 대하여 스트렙 트 아비딘 용액 (1mM이 2.4 μl를 추가100 mM의 onomer 나 2 HPO 4를 함유하는 스트렙 타비 딘 완충액, 100 mM의 염화나트륨, pH가 7.5; 총 비오틴의 4 당량). 나머지 튜브에 스트렙 타비 딘 버퍼의 2.4 μl를 추가합니다.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 모든 튜브 부화.
- 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 분석.
- 각각의 튜브에 6 배 로딩 버퍼 (블루 0.25 % 브로 모 페놀, 30 % 글리세롤)의 5 μl를 추가합니다.
- 부드럽게 솔루션을 섞는다.
- 로드 (10000 스톡 용액으로부터 1X GelRed 함유 0.5X TBE 버퍼를 1 % 아가 로즈) 아가로 스겔의 웰에 각 시료 10 μL.
- 약 80 V와 0.5 배의 TBE 버퍼에서 젤을 실행합니다. 1 시간.
- 필터 (540 ± 50 ㎚)를 구비 한 CCD 카메라와 UV 테이블 (312 ㎚)에서 DNA 밴드를 시각화.
참고 : 자외선은 눈과 피부에 손상됩니다.
더블 활성화의 보조 인자 (cofactor)를 통해 3. 2 단계 단백질 라벨링
- Methyltransf히스톤 H3 라이신 4 라벨 (수정 단계)에 대한 Set7 / 9 두 번 활성화 보조 인자 (cofactor) SeAdoYn 활성화 그룹 (MTAG)의 전송을 삭제-감독.
- 부품을 녹여 얼음에 반응 혼합물을 준비한다. 참고 : 항상 SeAdoYn이 저하를 방지하기 위해 냉각 유지.
- 분석 이외에 비 특정 변형을 시각화, "보조 인자"제어를 수행하고, "효소"제어는 형광 프로브의 비특이적 반응을 제외 할.
- 분석 용액 (20 μL) 변성 완충액 (50 mM Tris-HCl, 5 % 글리세롤, pH를 8.5), 10 μM 히스톤 H3, μM Set7 / 9 10 600 μM SeAdoYn (셀레늄 모두에서의 에피 머 혼합물)를 함유 준비. 마지막 단계에서는 다음 보조 인자 (cofactor) 및 MTase를 추가합니다.
- "보조 인자 (cofactor)"제어 3.1.3에서와 같이 분석 솔루션을 준비하고 합성 보조 인자 (cofactor)와 경쟁하기 위해 60 mM의 AdoMet를 추가합니다. "효소"제어를 위해 대신 SeAdoYn의 탈 이온수를 추가합니다.
- 서서히 상하로 피펫 팅하여 혼합 용액. 산도 스트립 (- 10의 pH 범위 5)의 상부에 각 필드 액 1 μl를 첨가하여 pH를 확인한다.
- 2 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 한편 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔을 제조 (실행 젤 : 357 mM의 비스 - 트리스의 pH 6.5-6.8, 0.1 % (/ V) APS w, 0.04 % (v / v)의 TEMED 12 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 37.5 : 1 ;로드 젤 : 357 mM의 비스 - 트리스 6.5-6.8 pH가 0.1 % APS (/ V w), 0.04 % (v / v)의 TEMED 5 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 37.5 : 1).
참고 : 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드는 유해 독성 및 건강이다. 이 절차를 수행하는 동안 장갑을 착용 할 것.
- 구리 촉매 아 지드 - 알킨 고리 (CuAAC) (라벨 단계)를 통해 히스톤 H3의 alkinylated 라이신 (4) 화학 라벨.
- 다만 변성 반응의 종료 이전 3mM의 CuSO 4, 3 mM의 트리스 (3- 히드 록시 프로필 - triazolylmethyl) 아민 (THPTA), 250 mM의 나트륨 아스 코르 베이트 및 6 mM의 TAMRA 지드를 함유 5X 클릭 믹스를 조제20 μL의 총 부피.
- CuAAC를 시작하고 수정 반응을 해소하기 위해 각 튜브에 새로 제조 한 5 배 클릭 믹스의 5 μl를 추가합니다.
- 피펫 팅 아래로 부드럽게 섞는다.
- 형광의 사진 표백을 방지하기 위해 빛 알루미늄 호일 모든 튜브를 보호합니다.
- 1 시간 동안 20 ° C에서 품어.
- 단백질 침전 무료 TAMRA의 형광 초과를 제거합니다.
- (34) - 무료 TAMRA의 형광의 집중적 인 겔 형광에 의한 형광 표지 된 히스톤 H3의 빛나며을 방지하기 위해, 단백질 (3.3.4 3.3.2)의 침전에 의해 초과 형광을 제거합니다.
- 75 μL 메탄올, 18.8 μL의 클로로포름 간략하게 각 추가 후에 각각의 튜브와 소용돌이에 탈 이온수 50 μl를 추가합니다. 5 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. 단백질을 포함하는 계면 층을 방해하지 않고, 상부 상을 제거한다.
- 나머지 단계로 56.3 μL 메탄올을 추가 난n은 5 분 16,000 XG에 각 튜브, 소용돌이와 원심 분리기는 단백질을 펠렛. 상층 액을 제거합니다. 펠렛을 씻어이 단계를 반복합니다.
- 보풀이없는 티슈로 열린 관을 덮고 15 그들을 말리면 - 30 분.
- SDS 페이지를 통해 분석.
- (20 μL SDS 로딩 완충액 (50 mM Tris-HCl, 2.5 % (w / V) SDS, 10 % (v / v) 글리세롤, 320 밀리미터 β 머 캅토 에탄올 및 0.05 % 3.3.4에서 침전 된 단백질을 녹이고 / w V) 브로 모 페놀 블루, pH를 6.8). 완전히 피펫 튜브의 벽을 세척하여 펠렛을 해산해야합니다.
- 10 분 동안 95 ° C에서 샘플을 품어하고 20 ° C까지 냉각 할 수 있습니다.
- 간단히 원심 튜브의 하단에있는 모든 액체를 수집한다.
- SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (3.1.7)의 우물에 각 시료의 전체 양을 넣습니다. 50mM의 MOPS, 50mM 트리스 - X (트리스 - 염기), 5mM의 EDTA, 0.1 % 사용 (/ w를 V) 전기 영동 완충액으로서 실행 SDS.
- 약 120 V를 사용하여 젤을 실행합니다. 90 분.
- 필터 (± 50 nm의 나노 540)를 구비 한 CCD 카메라와 UV 테이블 (312 ㎚)에서의 겔 형광을 시각화.
참고 : 자외선은 눈과 피부에 손상됩니다.
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Representative Results
아지리 딘의 보조 인자 (cofactor)를 통해 DNA의 한 단계 라벨링
이 예에서는 반응은 이중 가닥 5'-ATCG T-3 '서열 내에 제 아데닌 잔기를 수정하고있는 pBR322 플라스미드 (도 4a)에 하나의 인식 부위를 갖는 DNA MTase M.BseCI, 수행된다. 플라스미드 라벨을 테스트하려면, 나 pBR322는 제한 효소 (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 ')에 도전한다. R.TaqI는 M.BseCI 사이트에 포함되어있는 하나 나 pBR322에 7 부위를 갖는다. 라벨이 발생하면 M.BseCI 사이트 절단으로부터 보호되며, 다른 두 개의 단편 (315 및 368 BP)를 사라지고 동안 683 염기쌍 (BP)로 새로운 단편을 형성 할 것이다. 물론, 대응하는 인식 서열을 다른 DNA MTases REases와 상이한 DNA 라벨링을 분석 할 때 채용한다.
도 4b에서 아가 로스 겔 분명히 나타나는 도시683 BP (레인 3)로 새로운 조각의 ANCE. 이 M.BseCI 사이트의 라벨이 발생한 것을 보여줍니다. 만 분석 (레인 3)이 조각을 보여줍니다. "보조 인자 (cofactor)"제어 (레인 5)뿐만 아니라 "효소"제어 (레인 7)이 밴드를 누락되었습니다. 그것은 자연 보조인 AdoMet은 효소 제제에 존재하지 않는 것을 증명하기 때문에 특히 "효소"제어가 중요하다. 표지 반응의 특이성 (4c에도 4b 및 세부 사항)의 스트렙 타비 딘 첨가시 전기차 시프트 분석 (EMSA)에 의해 입증된다. M.BseCI 사이트 않고 모든 다른 단편의 이동성 제어 (레인 6 및 레인 4와 8과 비교)에 비해 불변 동안 683 염기쌍의 전기차 박약.
그림 4 : 순서M.BseCI 및 6BAz와 나 pBR322 플라스미드 DNA의 특정 바이오 틸. 인식 M.BseCI (적색)과 R.TaqI (녹색)를위한 사이트뿐만 아니라 DNA의 R.TaqI. B. 분석 제한 후의 염기쌍 (BP)에서 예상되는 DNA 단편의 길이를 나타내는 플라스미드 인 pBR322의 A. 맵 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분열과 EMSA. M = 마커, 레인 1 및 2 : 플라스미드 DNA 만, 레인 3 및 4 : 분석, 레인 5, 6 '보조 인자의 통제, 레인 7과 8, 「효소의 통제. 레인 2, 4, 6, 8은 추가 스트렙 타비 딘이 포함되어 있습니다. B.에서 삽입 C. 일시 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
더블 활성화의 보조 인자 (cofactor)를 통해 단백질의 두 단계 라벨링
더블 활성화 AdoMet 유사체와 기판들 MTase의 2 단계 라벨링 예를 들어 우리는 히스톤를 선택H3 라이신 4 (H3K4) MTase Set7 / (9)와 작은 SeAdoYn 공동 인자. 히스톤 H3 기판 (제 1 단계)에 활성화 된 프로 파길 그룹의 효소 전송 한 후, 터미널 알킨 화학적 CuAAC의 클릭 화학 (두 번째 단계)하여 아 지드 수정 TAMRA의 형광 표시되어 있습니다 (그림 3 비교). 라벨링 반응을 분석 한 SDS-PAGE에 의해 수행하고 겔 형광 검출 (도 5a)된다. 분석 (레인 1) 히스톤 보조 인자의 측쇄가 성공적으로 전송되었음을 나타내는 H3 및 TAMRA 형광 물질로 표지 된 변형 된 단백질에 대응하는 형광 밴드를 나타낸다. 어떤 밴드는 MTase에 의해 매개된다 "보조 인자 (cofactor)"와 히스톤 H3의 라벨을 보여주는 "효소"컨트롤 (레인 2, 3)에서 볼 수 없습니다. 따라서, 비 특정 화학적 라벨링 단독으로 보조 인자 (제 1 단계)에 의해 또는 CuAAC (단계 초) 동안 배제 할 수있다. "보조 인자 (cofactor)"제어 D 수행ifferently 원스텝 DNA 라벨링 프로토콜보다. 히스톤 H3가 침전 Set7 / (9)의 존재가 MTase 로딩 컨트롤 히스톤 H3의 양의 감소로 이어질 수있는 단백질을 생략하는 것이 효율이 좋기 때문이다. 따라서, 우리는 SeAdoYn와 경쟁 자연 보조 인자 (cofactor)의 AdoMet의 높은 농도를 추가했다. 히스톤 H3의로드가 쉽게 형광 검출 후 쿠마시 블루로 겔을 염색하여 제어 될 수있다.
MTase 기판은 화학 제 30 단계에서 바이오틴 지드 유도체 화를 이용하여 바이오틴 대신에 형광 물질로 표지 될 수있다. 단백질을 바이오 티 닐화 편리 고추 냉이 퍼 옥시 다제 - 콘쥬 게이트 아비딘 웨스턴 블 롯팅에 의해 분석된다. 이 Set7 / 9, SeAdoYn과 아 지드 수정 비오틴와 히스톤 H3의 바이오 틸 그림 (b)에 표시됩니다. 레인 1의 분석은 레이블 히스톤 H3에 대한 명확한 밴드를 보여줍니다. "효소"의 밴드의 부재 (레인 2)와 "보조 인자 (cofactor)"제어 (레인 3) 그 라벨이 MTase에 특이 다시 보여줍니다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질의 침전에 의해 과량의 비오틴 제거를 필요로하지 않기 때문에 "보조 인자"는 단순히 제어 MTase 단백질의 부재하에 수행된다.
그림 5 : 아 지드 - 유도 레이블을 클릭 반응 다음에 단백질 MTase Set7 / 9 SeAdoYn와 히스톤 H3의 레이블. 바이오틴 히스톤 H3 및 아비딘 - 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 접합체를 사용하여 컨트롤의 부하 제어를 위해 코마시 블루와 히스톤 H3 및 제어뿐만 아니라 염색을 TAMRA 표지. B. 웨스턴 블롯 분석 A.에서 - 겔 형광. 실험 조건은 A (효소 변형 형광 라벨링 된 것과 매우 유사 하였다 : 6.581; M 히스톤 H3, Set7 / 9 10 μM, 50 mM의 600 μM SeAdoYn, 트리스 -HCl, 5mM의의 MgCl 2, 5 % 글리세롤, pH가 9.0, 30 ℃, 3 시간; 화학 라벨 :. 0.6 mM의 CuSO 4, 0.6 mM의 THPTA, 50 MM의 아스 코르 빈산 나트륨, 1.2 mM의 비오틴 - 아 지드, 37 ° C, 1 시간) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
DNA의 MTases 아지리 딘 및 보조 인자 (미소 DNA)와 DNA의 1 단계 라벨링 강력한 방법이지만 실험을 계획 할 때 일부의 측면이 고려되어야한다.
아지리 딘 보조 인자 (cofactor) : M.BseCI와 DNA 라벨의 6BAz 농도가 60 μM이었다. 다른 DNA MTases 사용시 보조 인자 농도가 낮은 20 μM이 DNA MTase M.TaqI 19 채용 한 예 농도를 최적화한다. 낮은 농도 6BAz 스트렙 (분석에서 비오틴의 전체 양 중의 결합 부위)의 네 배 과량 직접 EMSA에 의해 분석을 방해하지 않고 REase 함께 인큐베이션 후에 첨가 될 수있는 이점이있다. 그렇지 않으면 과량의 비오틴 DNA 보조 인자를 제거하고, 아가 로스 겔 전기 영동시 DNA의 번짐을 방지하기 위해 정화되어야한다. DMSO의 원액에서 아지리 공동 인자를 추가 할 때 확인하는 일의 최종 DMSO 농도E 분석은 5 % 미만이다. 너무 많은 DMSO 효소를 비활성화 할 수 있습니다. 항상 저하를 피하기 위해 -80 ° C에서 아지리 보조 인자를 저장한다.
DNA MTase은 : DNA와 아지리 딘 보조 인자의 효소 결합은 강력한 제품 억제제와 DNA MTases가 화학 양 론적 양으로 사용 할 필요가 발생할 수 있습니다. 따라서 항상 DNA MTase 이상 1 당량을 사용합니다. 대부분의 DNA MTases 광범위한 투석 완충액 대량으로 열에 효소를 세척하여 제거 할 필요가 함께 결합 AdoMet copurify. "효소"제어 AdoMet 여전히 효소 준비에 존재하는지 여부를 알려줍니다. M.BseCI와 레이블은 37 ℃에서 하룻밤 배양하여 수행 할 수 있습니다.
버퍼는 수정 : DNA와 함께 아지리 딘 보조 인자의 비특이적 반응을 막기 위해 버퍼 10mm의 마그네슘 이온을 포함. 마그네슘 이온 오염 클레아의 활성화로 이어질 경우, 바륨 이온 대신에 첨가 될 수있다.
DNA의 순서 특정 레이블을뿐만 아니라 DNA 미소뿐만 아니라 MTAG 사용할 수있다. 여기서 이중 활성 보조 인자가 DNA의 고유 작용기 측쇄 효소의 전송에 사용된다. 이러한 관능기, 예를 들면 차 아민은, 제 2 단계에서 8,35,36 NHS 에스테르 화학 작용에 의해 바이오틴 혹은 형광 포함한 리포터 그룹의 다양한 변성 될 수있다. 또한 우리는 이미 리포터 그룹을 포함하는 큰 사이드 체인 더블 활성화 AdoMet 유사체를 합성하기 시작 한 단계로 DNA 라벨을 위해 그들을 사용했다.
이중 활성 보조 인자 SeAdoYn 가진 단백질 두 단계 MTAG 라벨링 절차가 성공적 단백질 MTases 30,31들과 함께 사용되어왔다. 그러나, 다음과 같은 코멘트 실험을 수행하기 전에 고려되어야한다.
더블 활성화 보조 인자 (cofactor) :이 보조 인자, 바다 포함doYn, 산성 조건 하에서 저장된 용품이 변형 용액의 pH가 크게 팩터 첨가시 변경하지 않는다는 점을주의해야한다. 우리는 항상 pH가 너무 낮 으면, pH를 조정하기 위해 수산화 나트륨 용액 (50 mM)을 소량 추가하여 pH 스트립 변성 액 1 μl를 첨가하여 pH를 확인하고. 또한 보조 인자 유사체는 pH 변화를 피하기 위해 저용량으로 첨가되어야한다. 따라서, 전체 변형에 필요한 최소한의 보조 인자 농도는 다른 MTases 결정되어야하고, 고도로 농축 보조인 스톡 용액이 바람직하다. 공동 인자 농도는 일반적으로 10 μM, 600 μM 사이에서 변화한다. 비활성 에피 머 종종 성취하기 어렵다로부터 AdoMet의 S의 -epimer에 대응하는, 황 또는 셀레늄 및 생물학적 활성 에피 머의 분리에서 에피 머의 1 : 1 혼합물 이중 활성 보조 인자의 화학적 합성은 일반적으로 대략 1을 산출한다. 따라서, 보조 인자 농도는전형적 이성질체의 혼합물 주어. 이중 활성 보조 인자 유사체 실온에서 매우 불안정하고 -20 ℃에서 보관해야한다. 또한 얼음에 주식 솔루션을 해동과 피펫 팅하는 동안 감기를 유지해야합니다. 그들은 다시 얼 수 있지만, 우리가 분주을하는 것이 좋습니다 재현 활동을 보장하기 위해.
단백질 MTase : MTases가 촉매의 양으로 사용할 수있는 더블 활성화 보조 인자와 변환하십시오. 그러나, MTases 자연 보조 인자 (cofactor)의 AdoMet와 분 -1 범위에서 매출 번호를 가진 느린 효소는 종종. 실용적인 이유로 우리는 자주 (일반적으로 10 분 2 시간 20 ° C ~ 37 ° C까지) 배양 시간 및 온도를 화학 양 론적 양 MTases를 사용하여 최소화 할 수 있습니다. "보조 인자"는 제어 리포터기를 검출의 유형에 따라 달라진다. MTase 레이블 비오틴은 생략하고, 단순히 분석 웨스턴 블로 팅 (그림 5B하여 수행 할 수 있습니다 들어 (도 5a)의 효소 적 전송을 방지하기 위해 추가되는 천연 보조인의 고농도로 수행된다. 히스톤 H3의 강수량은 단백질의 손실로 연결 경우, SDS-PAGE를 확장 할 수 있습니다 무료 TAMRA의 형광 초과는 bromphenol 푸른 전면 겔에서 실행됩니다.
수정 완충액 : 최적 효소 버퍼가 사용될 수 있지만, 티올, 디티 오 트레이 톨 (DTT)과 같은 β 머 캅토 에탄올, 피해야한다. 그들은 구리 이온와 b에 바인딩 다음 CuAAC 클릭 반응을 잠급니다.
CuAAC 반응하십시오 TAMRA 지드의 농도는 최종 농도 알킨 배 높아야한다. 생물학적 추출물을 사용하는 경우, 구리 및 리간드 농도는 5 mM의 각까지 증가되어야한다. TAMRA 아 지드는 물보다 DMSO에 잘 용해된다. DMSO의 최종 농도가 12 % 이하인지 확인합니다. 확장 배양 시간은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 단백질 손상과 번짐으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 라벨링 반응물 중 단백질 침전 또는 티올의 첨가에 의해 정지한다.
이 두 단계 라벨링 절차도 바이오틴 단백질 MTase 기판에 라벨을 사용할 수 있습니다 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬과 웨스턴 블롯 검출 (그림 5B) 또는 분리합니다. 또한, 더블 활성화 AdoMet 유사체는 해당 MTases와 DNA, RNA 및 작은 자연 제품에 라벨을 사용할 수 있습니다.
핵산 및 단백질에 대한 대부분의 다른 표지 방법에 비해 ve_content "> MTase 매개 라벨링 네이티브 기판에 직접 사용할 수 있다는 장점을 가지며, 더 변형 예. 물론, 치료는 천연 기질이 차단되지 않도록주의해야 할 필요가 없습니다 생체 내에서 상응 MTase 통해 메틸화. 또, MTase 매개 라벨링 MTases위한 바이오틴, 형광 또는 다른 분자 태그뿐 아니라 목표물을 포함 리포터 그룹의 관점 모두에서 매우 유연하다. REBASE, 제한하기위한 데이터베이스 엔도 뉴 클레아와 DNA MTases, 두에서 여덟 BP (37)에 이르기까지 서로 다른 인식 서열의 수백 700 개 이상의 실험적으로 특성화 된 DNA MTases을 나열하고이를 모든 종류의 200 개 이상의 서로 다른 MTases가 인간 세포 (38)에서 생산되는 것으로 예상된다. 중요한 결정을 MTase 활동에 대한 AdoMet 아날로그 효소 활성 부위에 맞는지이다. 제시된 보조 인자 6 있지만바즈와 SeAdoYn 일부 MTases 쉽게 그들을 받아 들일 수없는 경우가 있습니다, 작은 반응기을 갖도록 설계되어있다. 더 입체적으로 요구하는 이중 활성화 AdoMet 유사체로 28 - 35 DNA, RNA 및 단백질 23 MTases 25 입증 된 바와 같이 이러한 경우에는 활성 부위는 단백질 공학에 의해 확대 될 수있다. AdoMet 유사체와 DNA 및 RNA의 순서 특정 라벨이 유전자형 (DNA 매핑)에 대한 주요 관심 (36)과 메틸화 검출 (39)이며, DNA / RNA 및 DNA / RNA-수정 효소 (15)뿐만 아니라 (나노) 생명 공학 (13) 등을의 기능 연구, 도 14 및 19 유전자 전달. 순서 특정 공유 DNA 라벨을위한 다른 방법은 대상 장치로 또는 닉 번역 라벨링 다음 순서 특정 칼자국을내는 엔도 뉴 클레아 (NEases)에 합성 삼중 나선 형성 올리고 데 옥시 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 또는 머리 핀의 자형으로 폴리 아미드에 의존하고있다.
더블 활성화 AdoMet 유사체와 단백질의 특정 라벨은 주로 단백질 체학 연구, 복잡한 생물학적 혼합물 (27, 28)에서 단백질 MTases에 대한 새로운 기판의 예를 들어, 식별의 응용 프로그램을 지향했지만, 다른 응용 프로그램, 기능 연구처럼, 또한 가능해야한다. MTase 매개 라벨링은 주로 시험 관내 정제 MTases 수행하였으나 최근에보고되었다 (40)로서, 라벨은 살아있는 세포에서 달성 될 수있다. 물론, 특정 단백질 표지를위한 많은 다른 방법은 3,4 사용할 수 있습니다. 조작 된 세포를 이용하여 자연스러운 아미노산의 결합 외에도들은 일반적으로 자기 라벨 태그를 사용하여 원하는 단백질의 유전자 융합을 필요로 / 홍보효소 매개 라벨링 oteins 또는 태그. 이와 관련 단백질 MTases 용 기판으로서의 짧은 펩티드 서열은, 예를 들어 N 말단 히스톤 꼬리, 목적 단백질에 융합 될 수 있고, 구체적 AdoMet 유사체 및 대응 MTases 단백질로 표지.
44 - 마지막으로, 작은 분자 MTases의 생 촉매 레퍼토리 합성 AdoMet와 41 유사 확장 할 수 있습니다. 이 소설 생물학적 활동에 대한 심사 흥미로운 응용 프로그램을 찾을 수 있어야 천연 제품, 예를 들어 항생제 polyketides로 구조적 다양성을 소개하는 새로운 접근 방식을 나타냅니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
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