Methyltransferases और cofactor analogues साथ न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के अनुक्रम-विशिष्ट लेबलिंग
Summary
डीएनए और प्रोटीन अनुक्रम-विशेष रूप से आकर्षण या डीएनए या प्रोटीन Methyltransferases और सिंथेटिक cofactor के analogues का उपयोग कर फ्लोरोसेंट संवाददाता समूहों के साथ लेबल रहे हैं। एंजाइमों, aziridine या डबल सक्रिय cofactor के analogues के cofactor के विशिष्टता के आधार पर एक या दो कदम लेबलिंग के लिए कार्यरत हैं।
Abstract
एस -Adenosyl एल मेथिओनिन (AdoMet या एसएएम) निर्भर Methyltransferases (MTase) डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और छोटे biomolecules में विशिष्ट पदों के लिए AdoMet से सक्रिय मिथाइल समूह के हस्तांतरण को उत्प्रेरित। यह प्राकृतिक मेथिलिकरण प्रतिक्रिया सिंथेटिक cofactor के analogues का उपयोग कर alkylation प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का विस्तार किया जा सकता है। एक aziridine की अंगूठी के साथ AdoMet की प्रतिक्रियाशील sulfonium केंद्र की रिप्लेसमेंट विभिन्न डीएनए MTases से डीएनए के साथ मिलकर किया जा सकता है, जो सहकारकों की ओर जाता है। ये aziridine सहकारकों एडिनाइन आधा भाग के विभिन्न पदों पर संवाददाता समूहों के साथ सुसज्जित है और मुझे लगता है कि डीएनए (मुस्कुराते हुए डीएनए) के एल हाबिल आईएनजी nduced ethyltransferase- एस equence-विशिष्ट M के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में हम डीएनए MTase M.BseCI और aziridine cofactor के 6BAz में साथ 5'-ATCG ए टी 3 'अनुक्रम में pBR322 प्लास्मिड डीएनए की biotinylation के लिए एक प्रोटोकॉल देएक कदम है। एक ctivated जी roups (mTAG) के एम ethyltransferase निर्देशित टी ransfer के लिए उपयोग किया जाता है जो AdoMet analogues के दूसरे वर्ग में असंतृप्त अल्काइल समूहों परिणामों के साथ सक्रिय मिथाइल समूह का विस्तार। विस्तारित पक्ष श्रृंखला sulfonium केंद्र और असंतृप्त बंधन से सक्रिय रहे हैं, इन सहकारकों डबल सक्रिय AdoMet analogues के कहा जाता है। इन analogues के aziridine सहकारकों तरह डीएनए MTases के लिए सहकारकों, के रूप में कार्य किया है, लेकिन यह भी शाही सेना, प्रोटीन और छोटे अणु MTases के लिए ही नहीं। वे आम तौर पर एक दूसरे रासायनिक चरण में संवाददाता समूहों के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जो अद्वितीय कार्य समूहों के साथ MTase substrates के एंजाइमी संशोधन के लिए उपयोग किया जाता है। इस हिस्टोन H3 प्रोटीन की प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल में उदाहरण है। एक छोटा सा propargyl समूह के लिए क्लिक करें लेबलिंग द्वारा पीछा हिस्टोन H3 लाइसिन 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 से प्रोटीन के लिए cofactor के अनुरूप SeAdoYn से स्थानांतरित कर रहा हैTamra azide के साथ alkynylated हिस्टोन H3। Cofactor के analogues के साथ MTase की मध्यस्थता लेबलिंग पहचान और कार्यात्मक अध्ययन MTase substrates के रूप में अच्छी तरह के रूप में डीएनए जीनोटाइपिंग और मेथिलिकरण पता लगाने सहित कई रोमांचक अनुप्रयोगों के लिए एक प्रौद्योगिकी सक्षम है।
Introduction
न्यूक्लिक एसिड 1,2 और प्रोटीन 3,4 के विशिष्ट लेबलिंग कार्यात्मक अभिलक्षण, चिकित्सा निदान और (नैनो) जैव प्रौद्योगिकी के लिए प्रमुख ब्याज की है। यहाँ हम एस -adenosyl एल मेथिओनिन (AdoMet या एसएएम) निर्भर Methyltransferases (MTases) पर आधारित है जो इन बायोपॉलिमरों के लिए एक enzymatic लेबलिंग विधि प्रस्तुत करते हैं। एंजाइमों का यह वर्ग (ईसी 2.1.1।) न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की विशिष्ट अवशेषों के भीतर व्यक्तिगत न्युक्लेओफ़िलिक पदों (नाइट्रोजन, ऑक्सीजन, सल्फर और कार्बन परमाणुओं) को लक्षित करता है और स्वाभाविक रूप cofactor के AdoMet (चित्रा 1 ए) 5 के सक्रिय मिथाइल समूह स्थानान्तरण। इसके अलावा, MTases आत्मीयता टैग, fluorophores या अन्य लेबल (चित्रा 1 बी) 6 के साथ विशिष्ट लेबलिंग के लिए सिंथेटिक cofactor के अनुरूप उपयोग कर सकते हैं। AdoMet analogues के दो वर्गों विकसित किया गया है: एस equence-विशिष्ट एम ethyltransferase- के लिए मैं Aziridine सहकारकों </strong> Nduced एल हाबिल आईएनजी (मुस्कुराते हुए) 7 और एक ctivated जी roups के मीटर ethyltransferase निर्देशित टी ransfer के लिए डबल सक्रिय AdoMet analogues (mTAG) 8।
चित्रा 1:।। Methyltransferases (MTases) डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और छोटे जैवअणुओं सहित विभिन्न substrates के लिए प्राकृतिक cofactor के AdoMet (एसएएम) से ए मिथाइल समूह स्थानांतरण न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की बी लेबल / functionalization (NNNNN = द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं प्रोटीन के लिए शाही सेना और अमीनो एसिड के लिए आधार डीएनए के लिए जोड़े, न्यूक्लियोटाइड, सिंथेटिक cofactor के analogues के साथ हरे रंग में लक्ष्य छाछ) के साथ MTase की XXXXX = मान्यता अनुक्रम। एक पत्रकार समूह युक्त Aziridine सहकारकों (नीले क्षेत्र)विशेष रूप से लक्ष्य छाछ (बाएं) और डबल सक्रिय AdoMet analogues के साथ युग्मित अनुक्रम एडिनाइन अंगूठी करने के लिए कर रहे हैं संलग्न चरण में एक दूसरे bioorthogonal क्लिक प्रतिक्रिया से लेबल किया जा सकता है, जो एक रासायनिक संवाददाता वाई (दाएं) को ले जाने के लिए बढ़ाया अल्काइल श्रृंखला के हस्तांतरण के लिए सीसा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Aziridine सहकारकों डीएनए MTases के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं। वे एक नाइट्रोजन परमाणु 9 (या एक एन 10,11 -mustard) के बजाय sulfonium केंद्र के रूप में प्रतिक्रियाशील समूह के साथ एक तीन अंग का अंगूठी होते हैं। इस नाइट्रोजन परमाणु के Protonation डीएनए के साथ पूरे cofactor के युग्मन सहसंयोजक की ओर जाता है, जो लक्ष्य न्यूक्लियोटाइड द्वारा न्युक्लेओफ़िलिक हमले के लिए aziridine अंगूठी सक्रिय। एडिनाइन अंगूठी के लिए रिपोर्टर समूहों संलग्न द्वारा aziridine सहकारकों (एक कदम में डीएनए लेबल करने के लिए डीएनए MTases साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है <stron जी> बाएं चित्रा 1 बी), 7,12। , 15 (एडिनाइन अंगूठी के 6 स्थिति से जुड़ी बायोटिन के साथ aziridine cofactor के) और बेसिलस stearothermophilus से एडिनाइन विशिष्ट डीएनए MTase (M.BseCI) 16 (चित्रा 2 – यह 6BAz 13 के साथ डीएनए की biotinylation के लिए विस्तार से प्रदर्शन किया है ) डीएनए से एक कदम लेबलिंग aziridine सहकारकों के माध्यम से: प्रोटोकॉल खंड 2 देखें। हेमोफिलस heamolyticus से M.BseCI (5'-ATCG ए टी 3 'मान्यता अनुक्रम), Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-टीसीजी ए -3 से डीएनए MTases'), के अलावा (M.HhaI, 5 'जी सी जी सी-3') और Spiroplasma (M.SssI से, 5'- सी जी-3 ') सफलतापूर्वक 6BAz 17 के साथ डीएनए biotinylate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, aziridine सहकारकों एक कदम प्रतिदीप्ति डीएनए लेबलिंग 18,19 के लिए नियोजित किया जा सकता है।
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चित्रा 2:। M.BseCI और 6BAz साथ डीएनए के अनुक्रम विशिष्ट एक कदम biotinylation डीएनए MTase M.BseCI डबल असहाय डीएनए अनुक्रम 5'-ATCG ए टी 3 'को पहचानता है और स्वाभाविक रूप से दूसरे एडिनाइन के अमीनो समूह methylates छाछ (हरा) AdoMet का उपयोग कर। Aziridine cofactor के 6BAz के साथ प्रतिक्रिया की दिशा बदल दी है और M.BseCI लक्ष्य एडिनाइन साथ बायोटिन (नीला) सहित पूरे cofactor के युग्मन द्वारा विशिष्ट डीएनए biotinylation अनुक्रम की ओर जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
डबल सक्रिय AdoMet analogues के असंतृप्त पक्ष श्रृंखला के बजाय sulfonium केंद्र में एक मिथाइल समूह (चित्रा 1 बी विस्तारित होते </stronG>, दाएं) 20। sulfonium केंद्र के लिए β-स्थिति में असंतृप्त डबल या ट्रिपल बंधन को इलेक्ट्रॉनिक conjugative स्थिरीकरण द्वारा संक्रमण राज्य के भीतर प्रतिकूल steric प्रभाव compensates। Sulfonium केंद्र और असंतृप्त बांड दोनों एंजाइमी हस्तांतरण के लिए पक्ष श्रृंखला को सक्रिय करने के बाद, इन सहकारकों डबल सक्रिय AdoMet analogues के नाम थे। आमतौर पर, वे एक दूसरे कदम 8,21 में केमो-चयनात्मक लेबलिंग के लिए, अमीनो, alkyne और azide के समूहों की तरह अद्वितीय रासायनिक समूहों (रासायनिक संवाददाताओं से), के साथ पक्ष श्रृंखला स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। आरएनए और प्रोटीन की अतिरिक्त लेबलिंग की अनुमति के 28 – सामान्य में, डबल सक्रिय AdoMet analogues के शाही सेना MTases 22,23 डीएनए MTases 8,20,21 के लिए, लेकिन यह भी के लिए सहकारकों और प्रोटीन MTases 24 के रूप में न केवल कार्य कर सकते हैं। हालांकि, विस्तारित पक्ष श्रृंखला sterically अधिक एक मिथाइल समूह की तुलना में मांग और इंजीनियरिंग बहुधा है प्रोटीन से MTase सक्रिय साइटों विस्तार कर रहे हैंएन कुशल अंतरण दर प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। कॉपर द्वारा रासायनिक संशोधनों के बाद के लिए एंजाइमी स्थानांतरण के दौरान संक्रमण राज्य के 1. स्थिरीकरण और 2. प्रतिक्रियाशील हैंडल: इस समस्या के लिए एक और समाधान के लिए एक छोटा सा propargyl टर्मिनल alkyne दो कार्यों में कार्य करता है जहां समूह (तीन कार्बन) के साथ एक AdoMet अनुरूप उपयोग करने के लिए है उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) रसायन शास्त्र क्लिक करें। यह जिसके परिणामस्वरूप propargylic AdoMet अनुरूप 29 तटस्थ या थोड़ा बुनियादी शर्तों के अधीन है और केवल सीमित उपयोग की काफी अस्थिर है कि बाहर कर दिया। इस खामी सेलेनियम के साथ सल्फर परमाणु जगह से तय किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप cofactor के 5 '- [(एसई) [(3) एस -3 अमीनो-3-carboxypropyl] सहारा-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosine (SeAdoYn, चित्रा 3) जंगली प्रकार के डीएनए द्वारा स्वीकार किया जाता है, आरएनए और प्रोटीन MTases 30 – कई मामलों में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए की जरूरत रद्द जो 32। इस प्रतिदीप्ति समर्थक द्वारा उदाहरण है हिस्टोन H3 लाइसिन साथ Tein लेबलिंग 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: डबल सक्रिय सहकारकों के माध्यम से दो कदम प्रोटीन लेबलिंग चित्रा 3, प्रोटोकॉल धारा 3 देखें)।
चित्रा 3:। Set7 / 9 के साथ हिस्टोन H3 के अनुक्रम विशिष्ट दो कदम प्रतिदीप्ति लेबलिंग, SeAdoYn और Tamra azide के प्रोटीन MTase Set7 / 9 स्वाभाविक रूप से AdoMet का उपयोग करते हुए हिस्टोन H3 में लाइसिन 4 के अमीनो समूह (H3K4, हरा) methylates। डबल सक्रिय cofactor के साथ SeAdoYn MTase लाइसिन अवशेषों को एक छोटे से propargyl समूह (लाल) स्थानान्तरण। संलग्न टर्मिनल ट्रिपल बंधन तो चुनिंदा azide-derivatized Tamra (tetramethylrhodamine, नीला) फ्लोरोफोरे के साथ एक bioorthogonal क्लिक प्रतिक्रिया (तांबा-उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition, CuAAC) में संशोधित किया गया है।लोड / 52,014 / 52014fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए MTases और aziridine सहकारकों (मुस्कुराते हुए डीएनए) के साथ डीएनए से एक कदम लेबलिंग एक मजबूत तरीका है, लेकिन प्रयोग की योजना बनाते समय कुछ पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए।
Aziridine cofactor: M.BseCI के साथ डीए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Kerstin Glensk for preparing the MTases M.BseCI and Set7/9 and gratefully acknowledge funding by the Excellence Initiative of the German Federal and State Governments and RWTH Aachen University. The authors are happy to provide 6BAz and SeAdoYn or other cofactor analogues for collaborative research.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expressionplasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expressionplasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expressionplasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodiumhydrogenphosphat | Merck | 106,586 | |
| TAMRA-azide | |||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
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