Summary
-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.
Abstract
Microdissectie is een nieuwe techniek die specifieke gebieden van een weefsel isoleren en te elimineren verontreiniging uit cellulaire bronnen in naburige gebieden. Deze werkwijze werd eerst gebruikt in de studie van Nestin-expressie voorlopers (NEP), een onlangs geïdentificeerde populatie van cellen in de cerebellaire externe kiemlaag (EGL). Met behulp microdissection in combinatie met fluorescerende-geactiveerde cel sortering (FACS), werd een zuivere populatie van NEPs gescheiden ingezameld van conventionele korrel neuron voorlopers in de EGL en van andere vervuilende Nestin expressie cellen in de kleine hersenen. Zonder microdissection, functionele analyses van NEP zou niet mogelijk zijn geweest met de huidige methoden beschikbaar, zoals Percoll gradiëntcentrifugering en lasermicrodissectie. Deze techniek kan ook worden toegepast voor gebruik met verschillende weefsels die ofwel herkenbare gebieden of fluorescent-gelabelde cellen bevatten. Het belangrijkste is een groot voordeel van deze microdissection techniek is dat geïsoleerde cellen leven en kan worden gekweekt voor verdere experimenten, die op dit moment niet mogelijk is met andere methoden beschreven.
Introduction
Het cerebellum bestaat uit meerdere cellagen, die elk verschillende celtypen. Tijdens de ontwikkeling van de EGL bevat prolifererende korrel neuron voorlopers (BNP), terwijl de moleculaire laag en Purkinje lagen bevatten Bergmann glia en Purkinje neuronen, respectievelijk. Diep in het cerebellum ligt de witte stof, die neurale stamcellen (NSC's) en oligodendrocyten 1 bevat.
Sonic hedgehog (Shh) speelt een cruciale rol bij het reguleren van ontwikkeling van het cerebellum en in het bijzonder bevordert de proliferatie van BNP via binding aan zijn receptor Patched (Ptc), een negatieve regulator van Shh signalering 2-4. Afwijkende activering van Shh signalering genereert medulloblastoom (MB), de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor bij kinderen 5,6.
Ptc mutant MB transgene muismodellen zijn krachtige instrumenten voor de studie van de MB en tumoren lijkt menselijk MB 7,8 ontwikkelen. Met behulp van dezemuizen, werd ontdekt dat BNP zijn de cel van oorsprong voor egel-achtige MB 7. Bovendien, naast BNP hebben we recent geïdentificeerde een unieke populatie van neuronale voorlopercellen binnen de EGL van de ontwikkeling cerebellum die ook tot MB kan geven. Deze cellen brengen hoge niveaus van het type VI intermediaire filament-eiwit, Nestin en zogenaamde NEPs 9. NEPs zijn gelegen binnen het diepe deel van de EGL en bestaan kortstondig alleen tijdens de neonatale ontwikkeling van het cerebellum. Ze verbinden zich tot de korrel cellijn als BNP, maar zijn verschillend als ze zijn in rust en niet te uiten Math1, een gevestigde marker voor conventionele BNP 10. Bovendien NEPs leiden tot MB efficiënter dan BNP na activering van de Shh signaleringsroute 9, waardoor ze een nieuwe oorsprong MB tumorvorming maakt.
We hebben eerder geïsoleerd NEPs van de cerebellaire EGL op postnatale dag 4 (P4) van de microdissection techniekhier 9 beschreven. Microdissection via directe microscopische visualisatie van het weefsel maakt bepaalde ontleding van de cerebellaire EGL. Dit is nodig omdat Nestin ook door NSC wordt uitgedrukt in de cerebellaire witte stof en Bergmann glia in de moleculaire laag 1,7,11,12 en het cruciaal dat deze cellen niet worden opgenomen, aangezien de analyse zouden verwarren. Cellen geïsoleerd uit gemicrodisseceerde weefsel kan direct worden gebruikt voor moleculaire analyse of kunnen worden gekweekt voor verdere toepassingen.
Om te helpen bij specifiek microdissecting de EGL en NEPs verder te zuiveren, Math1-GFP (groen fluorescerend eiwit) muizen werden gekruist met Nestin-CFP (cyaan fluorescente eiwit) muizen. De transcriptiefactor Math1 is speciaal ontworpen door BNP en GFP expressie uitgedrukt is duidelijk zichtbaar in de EGL 9,13. Nestin-GVB muizen brengen een nucleaire vorm van GVB en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in de moleculaire laag 9,14. Samen, GFP en GVB uitdrukking creëren grenzen voor microdissection van de EGL (zie figuur 1). GVB-positieve NEPs werden vervolgens geïsoleerd door FACS, na enzymatische dissociatie van de ontleed WR.
Momenteel is de meest gebruikte methode om cellen te isoleren uit de EGL is Percoll gradiënt centrifugering van geheel cerebellaire weefsel 15,16. Deze werkwijze is echter niet volledig uit te sluiten Nestin + celpopulaties van de moleculaire laag en witte stof en kan daarom niet worden gebruikt voor de studie van NEP. Laser capture microdissectie, de overdracht van laserenergie gebruikt om cellen van belang te verwijderen, is een andere methode om specifieke cellen te isoleren in een heterogeen weefsel 17,18 maar gevangen cellen kan alleen worden gebruikt voor het terugwinnen van DNA, RNA en eiwitten en niet kunnen worden gekweekt.
Dit protocol biedt een manier om specifiek te isoleren een levende, zuivere populatie van NEPs van de EGL.Deze techniek kan ook worden toegepast op verschillende types weefsel dat ofwel herkenbare anatomische architectuur of fluorescent gelabelde cellen / regio's. Daarom is het grote voordeel van het opnemen van deze nieuwe techniek microdissectie in celisolatie protocollen die cellen kunnen worden geïsoleerd uit specifieke weefselgebieden elimineren verontreinigende naburige weefsels en cellen kan onmiddellijk voor analyse gekweekt of voor andere toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gebruik van dieren in dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met de procedures die door de Fox Chase Cancer Center Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
1 Voorbereiding van de instrumenten, oplossingen en Coverslips
- Clean twee sets van # 5 fijne tang, een set van # 7 fijne gebogen pincet, een grote chirurgische schaar, een microdissecting schaar, een spatel en een geperforeerde lepel. Plaats de instrumenten in een zelfdichtende sterilisatie zakje en autoclaaf. Houd instrumenten in zakje tot aan gebruik.
- Bereid een 3% laagsmeltende agarose oplossing.
- Voeg 1,5 g agarose in 50 ml steriele Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) dan plaats in de magnetron en verhit tot belletjes. Swirl kolf en opwarmen totdat alle agarose is opgelost. Meng de oplossing met een roerstaafje alvorens het verwarmen wanneer er klontjes verschijnen.
- WINKEL oplossing in een 37 ° C waterbad totdat het nodig is.
- Voor de lange termijn opbergdoose Bewaar de agarose oplossing voor toekomstig gebruik bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende maanden. Opwarmen in de magnetron te vloeibaar te maken. Voor herhaalde verwarming van de agarose-oplossing Weeg de kolf vóór te verwarmen tot het begingewicht met warm steriel gedistilleerd water te handhaven.
- Bereid de volgende oplossingen voor papaïne gebaseerde cel dissociatie zoals eerder beschreven 2:
- Een papaïne oplossing met papaïne (100 U / ml), cysteïne (0,2 mg / ml) en DNase (250 U / ml) in steriele fenolrood-bevattende DPBS.
- Een ovomucoïd oplossing met runderserumalbumine (BSA, 8 mg / ml), sojaboon trypsine inhibitor (8 mg / ml)) en DNase (250 U / ml) in steriele fenolrood-bevattende DPBS.
Filter steriliseren beide oplossingen en pas de pH aan de originele kleur van fenol rood-met DPBS terugkeren.
- Bereid celkweekmedium (NB / B27): basale media aangevuld met 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM L-glutamine, 1% penicilline-streptomycine (P / S) en B27 supplement. Filter steriliseren en beschermen tegen licht. Equilibreer media bij 37 ° C en 5% CO2 vóór gebruik.
- Bereid FACS buffer: 5% foetaal bovine serum (FBS) in DPBS. Voeg 2,5 ml FBS tot 47,5 ml DPBS.
- Bereid poly-D-lysine (PDL) -gecoat dekglaasjes.
- Autoclaaf nieuwe dekglaasjes.
- Coat de dekglaasjes met PDL (100 ug / ml in steriel gedestilleerd water) en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C of kamertemperatuur.
- Was dekglaasjes met steriel gedestilleerd water. Was eenmaal met NB / B27 media. Laat dekglaasjes drogen in weefselkweek kap voor gebruik.
2 Dissection en voorbereiding van Tissue Slices
- Op de dag van de dissectie, vegen van de dissectie met 70% ethanol en deksel met een absorberend kussen.
- Verwijder dissectie-instrumenten uit de sterilisatie zakje. Voeg ijskoud, steriele DPBS / 1% P / S om een kleine petrischaal en plaats op ijs.
- Onthoofd P4 Math1-GFP / Nestin-GVB muis pups met grote chirurgische schaar houd dan het hoofd naar beneden met fijne gebogen pincet. Verwijder de schil en voorzichtig afpellen van de schedel met # 5 fijne tang dan schep de hersenen uit de schedel met behulp van een spatel en breng het naar de petrischaal met DPBS / 1% P / S.
- Met nr.5 fijne tang voorzichtig scheiden de kleine hersenen van de rest van de hersenen. Zorg ervoor dat u een pup te ontleden in een tijd zo snel mogelijk.
- Verzamel minimaal 8 cerebella om genoeg NEPs voor moleculaire en functionele analyses te verkrijgen.
- Vul een inbedding matrijs meet 2 x 2 x 2 cm met een 3% laagsmeltende agarose oplossing. Zorg ervoor dat de temperatuur van agarose is niet meer dan 37 ° C.
- Verwijder overtollige vloeistof uit de kleine hersenen door deppen zachtjes op een laboratorium weefsel. Plaats cerebellum in vorm in een verticale positie. Plaats de mal op ijs om het snel stollen. Gebruik ~ 4 cerebella per blok.
- Verkrijgen liVing weefsel secties met trillend mesje vibratome. Trim-cerebella met agarose blok met een scheermesje. Lijm de agarose blok naar de vibratome plaat met cerebella in verticale positie.
- Vul de lade van de vibratome met ijskoude steriele DPBS / 1% P / S en plaats ijs eronder.
- Snijd 600 urn secties door de gehele lengte van cerebellum. Verzamel delen van het ijs lade met behulp van een geperforeerde lepel. Plaats secties in een petrischaal gevuld met DPBS / 1% P / S op het ijs.
3 Microdissection en celdissociatie
- Plaats de petrischaal met weefsel plakjes onder een tl-dissectie microscoop.
- Onafhankelijke voorzichtig EGL van de rest van de cerebellaire gedeelte met fijne pincet door ontleden tussen de GVB + moleculaire laag en GFP + EGL (zie gestippelde lijn in figuur 1). Zorg om een deel van de moleculaire laag exclusief, wat zal resulteren inverontreiniging van-Nestin uiten Bergmann glia.
- Moet u deze stap zo snel mogelijk en houden het weefsel op het ijs om celdood te vermijden.
- Verwijder de agarose rond het weefsel voordat u verder gaat naar de volgende stap.
- Digest de gemicrodissecteerde EGL weefsel met een papaïne-gebaseerd protocol zoals eerder beschreven 2 om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Resuspendeer cellen in FACS buffer voor het verzamelen van de GVB-positieve cellen via FACS.
4 Cell Sorting en Plating
- Sorteer cellen voor GVB fluorescentie met behulp van een steriele, hoge snelheid stroomcytometer met een geschikte GVB filter en cellen in FACS buffer te verzamelen op het ijs. Verkrijgen van ongeveer 100.000 NEPs uit elke P4 cerebellum.
- Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten. Gebruik cellen onmiddellijk voor moleculaire analyse of cultuur voor verdere experimenten.
- Tot cultuur cellen, re-opschorten van de cellen in de voorverwarmde NB / m B27edia en plaat op PDL-gecoate dekglaasjes zoals eerder beschreven 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals getoond in figuur 1A werden cerebellaire plakjes bereid uit P4 Math1-GFP / CFP Nestin-muizen, waarbij de cerebellaire EGL gedomineerd door GFP-expressie BNP en de moleculaire laag werd verrijkt door CFP-positieve gliacellen. Om NEPs die zich in het diepe gedeelte van de EGL isoleren, werden plakjes gemicrodissecteerde tussen EGL en moleculaire laag (langs streeplijn Figuur 1A). Ontlede WR (Figuur 1B) werden vervolgens verzameld enzymatische dissociatie gevolgd door FACS.
Zoals verwacht, de meerderheid (meer dan 85%) van cellen in de ontlede EGL waren conventionele BNP, die voor GFP (Figuur 2A) positief waren. NEP (GVB +) zijn goed voor slechts ongeveer 5% van de EGL celpopulatie. Vrijwel geen van de cellen dubbel positief voor GFP en CFP basis van de FACS-analyse. GVB + cellen gezuiverd door FACS, werden gekweekt in vitro de differentiatie pote onderzochtntial. Zoals getoond in figuur 2B, NEPs heeft uitsluitend tot β-tubuline + neuronen na 4 dagen in cultuur suggereert NEPs worden lineage beperkte neuronale voorlopercellen.
Door deze microdissection protocol, werden NEPs en BNP ook gezuiverd van de EGL PTC tekort cerebellum. Bij intracraniale transplantatie NEPs ontwikkelen MBs sneller opzichte BNP, wat aangeeft dat NEPs bijzonder gevoelig voor oncogene transformatie 9.
Figuur 1 Identificatie van dat gebied EGL microdissectie. Fluorescerende beelden van P4 Math1-GFP / CFP Nestin-dieren. (A) GFP expressie in de EGL, terwijl de meerderheid van GFP expressie in de moleculaire laag. Microdissection werd gedaan langs thij gele stippellijn. (B) WR werden verzameld voor weefsel dissociatie. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Li et al 9.
Figuur 2 NEPs vormen een kleine populatie van cellen in de EGL en zijn lineage beperkte neuronale voorlopercellen. (A) Flowcytometrieanalyse van GVB + cellen geïsoleerd uit gemicrodissecteerde EGL. (B) NEP's werden gekweekt onder differentiatie voorwaarden voor 4 dagen en gekleurd voor β-tubuline (rood) en tegengekleurd met DAPI (blauw). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Li et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De microdissectie hier beschreven methode is de eerste procedure kunnen een zuivere populatie van levende cellen voor gebruik in moleculaire en functionele analyses isoleren. Zoals aangetoond door Li et al. 9, NEPs deze methode verkregen kan worden gekweekt en verwerkt in verschillende experimenten en vanwege hun hoge zuiverheid, kan ook worden gebruikt voor microarray-analyse.
Het is zeer belangrijk de tijd te nemen om bedreven met dit microdissectie techniek geworden. NEP zijn in het diepe gebied van de EGL in nabijheid van de moleculaire laag, waar-Nestin expressie Bergmann glia de NEP celisolatie kan vervuilen en een kwetsbaar zuiverheid. Microdissection moet daarom behoudend worden gedaan om te zorgen besmetten cellen in aangrenzend weefsel zijn niet inbegrepen maken. Het grote voordeel van de microdissectie techniek beschreven is de mogelijkheid om levende cellen te verkrijgen die kunnen worden gekweekt nbsr experimenten. Daarom is het cruciaal dat alle stappen tijdens deze procedure snel gebeuren en dat weefsel op ijs zoveel mogelijk worden gehouden. Bovendien moeten alle instrumenten en reagentia steriel zijn. Door deze stappen celdood en celcultuur besmetting te beperken. Daarnaast zal montage van meer cerebella per agarose blok helpen bij het verminderen de proceduretijd.
Deze techniek is niet beperkt tot isolatie van NEP en kan worden gebruikt om cellen uit andere gebieden van het cerebellum, zoals gliacellen van de moleculaire laag en neurale stamcellen van de witte stof te verzamelen. Naast het cerebellum, microdissectie kan worden gebruikt met andere weefsels herkenbare gebieden zoals de hippocampus bevatten, bijvoorbeeld. Het gebruik van fluorescente transgenen, zoals hier gebruikt, kan helpen bij het creëren van randen of identificeren van gebieden voor dissectie, die vooral nuttig zijn in weefsels die gemakkelijk identificeerbare gebieden ontberen en anders niet kunnen worden microdissected. Deze techniek kan ook helpen bij de cel zuiveringen in een breed scala van onderzoeksgebieden en toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag James Oesterling bedanken voor flowcytometrie hulp. Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie van het Amerikaanse National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) en een Amerikaanse National Institutes Postdoctoraal opleiding subsidie (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
