Внутривенных инъекций в новорожденных мышей
Summary
Животные модели детской болезни могут испытать раннее возникновение и прогрессирование агрессивное заболевание. Клинически значимые доставка терапия для молодых мышах может быть технически сложно. Этот протокол описывает неинвазивный внутривенного метод впрыска для новорожденных мышей в течение первых двух послеродовых дней жизни.
Abstract
Внутривенная инъекция является клинически применимо манера доставить терапевтические. Для взрослых грызунов и более крупных животных, внутривенные инъекции, технически осуществимо и рутина. Тем не менее, некоторые модели мышей могут иметь раннее начало заболевания с быстрым прогрессированием, что делает администрация потенциальных методов лечения трудно. Временной (или лица) вена просто передней к ушным вкладышем на мышах и отчетливо видна в течение первых двух дней после родов по обе стороны от головки с использованием рассекает микроскопом. В течение этого окна, временная вены может быть введен с объемами до 50 мкл. Инъекция является безопасным и хорошо переносится как детенышей и плотин. Типичная процедура инъекции завершается в течение 1-2 мин, после чего щенок возвращается к домашней клетке. К третьему день после рождения жила трудно представить себе и процедура инъекции становится технически ненадежны. Эта техника была использована для доставки вируса аденоассоциированный (AAV) VectПРС, что в свою очередь может обеспечить почти тела шириной, стабильную экспрессию трансгена для жизни животного в зависимости от вирусной серотипа выбранной.
Introduction
Доставка терапевтических до центральной нервной системы (ЦНС) в мышиных моделях инфекции у детей остается проблемой. Мыши, которые модели новорожденных болезненных состояний являются низкорослыми, а с развитием незрелыми, и, следовательно, может быть трудно вводить непосредственно в соответствующих структур в ЦНС. Внутрисосудистого введения терапевтических агентов является неинвазивным, хорошо переносится метод доставить клетки, наркотики, или вирусные векторы для всего тела, включая ЦНС 1-5 и сетчатки 3,5-9. Предыдущие публикации описывают временную инъекции лицо вен с помощью просвечивания 10,11, без микроскопом рассечение 11,12, или требующих двух лиц, чтобы ввести 10. Техника инъекции описано в данном протоколе выгодно, потому что один человек может придать щенков, и источник света, чтобы просмотреть временная вена не касаясь щенка, устраняя необходимость в хирургической кассете или прикрепление щенка к неподвижной поверхноститакие как просвечивания 11. Доставка аденоассоциированного вирусный вектор серотипа 9 (AAV9) у мышей производит сильную экспрессию в нейронах и астроцитов всему головного и спинного мозга (рис 1). Внутрисосудистого доставка вирусных векторов в поверхностной височной лица вены была надежно использоваться в различных исследованиях в неонатальном мышей лечить педиатрической нервно-мышечной расстройства Спинальная мышечная атрофия (СМА) 2,4,13,14 и в конечном счете увеличивается продолжительность жизни мышей.
Внутрисосудистого введения новорожденных мышей также эффективно нацелен на периферическую нервную систему и периферические органы (рис 2). После инъекции AAV, трансдукция ганглиях задних корешков, печени, сердца, скелетной мышце, легких, мышечной оболочки кишечника и сплетения кишечника наблюдалось 1,3,6,7,15. Широкое трансдукция ЦНС и на периферии делает этот метод впрыска идеала для заболеваний, требующих глобального выражениетрансген, таких как болезни 16 и другие хранилища лизосомальных болезней Гоше 17,18, болезни Баттена и связанных с ними нейронов цероид lipofuscinoses, 19 и синдромом Барде-Biedl, генетическое заболевание мультисистемной с момента появления симптомов, возникающих в раннем детстве 20. Внутрисосудистого введения в неонатальном мышей также следует рассматривать в качестве нового метода общесистемных моделирования педиатрических заболеваний. Эта техника была переведена на более крупных животных моделях 5,21 и внутрисосудистой инъекции уже существует в виде клинически приемлемый метод доставки терапевтических.
Текущий протокол описывает простой, эффективный метод не доставки агентов на новорожденных мышах через поверхностной височной лица вены не позднее послеродовой день 2. Инъекции могут быть укомплектованы одной, практикуется индивидуальный и хорошо переносится как детенышей и плотин. Щенки испытывать минимальное бедствие и быстро восстанавливаться. ImportanTLY, успешно впрыска приведет к глобальной доставки средства, вводимого. Этот протокол является подходящим для доставки вирусных векторов, фармацевтических агентов или клеток, к новорожденных мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Внутрисосудистого поставка агентов в ЦНС или по всему телу трудно в неонатальных мышиных моделях болезни. Описанный протокол является быстрым, относительно неинвазивным способом внутривенно вводить растворы в неонатальном мышей с минимальными требованиями к оборудованию. Хотя врем…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают NINDS, FightSMA и семьям SMA для финансовой поддержки. SEGL поддерживается NINDS учебного гранта # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Thinpro Insulin Syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10cc, 3/8" needle, 30G, 1 per mouse |
| Evans Blue Dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting Microscope |
Referências
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
- Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
- Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
- Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
- Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
- Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
- Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
- Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
- Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
- Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
- Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
- Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).
