Las inyecciones intravenosas en ratones recién nacidos
Summary
Los modelos animales de enfermedad pediátrica pueden experimentar aparición temprana y progresión de la enfermedad agresiva. Clínicamente entrega terapia pertinente a jóvenes modelos de ratón puede ser técnicamente difícil. Este protocolo describe un método de inyección intravenosa no invasivo para ratones recién nacidos dentro de los dos primeros días después del parto de la vida.
Abstract
La inyección intravenosa es una forma clínicamente aplicable para entregar agentes terapéuticos. Para roedores adultos y los animales más grandes, las inyecciones intravenosas son técnicamente viables y la rutina. Sin embargo, algunos modelos de ratones puede tener la aparición temprana de la enfermedad con una progresión rápida que hace que la administración de terapias potenciales difícil. La vena temporal (o facial) está justo anterior a la brote del oído en ratones y es claramente visible durante los dos primeros días después del nacimiento a cada lado de la cabeza utilizando un microscopio de disección. Durante esta ventana, la vena temporal puede ser inyectado con volúmenes de hasta 50 l. La inyección es segura y bien tolerada tanto por los cachorros y las presas. Un procedimiento de inyección típico se completa en 1-2 min, después de lo cual el cachorro es devuelto a la jaula de alojamiento. Al tercer día después del parto la vena es difícil de visualizar y el procedimiento de inyección se convierte técnicamente confiables. Esta técnica se ha utilizado para la entrega de virus adeno-asociado (AAV) vectORS, que a su vez pueden proporcionar casi en todo el cuerpo, la expresión transgénica estable para la vida del animal dependiendo del serotipo viral elegido.
Introduction
Entrega de la terapéutica en el sistema nervioso central (SNC) en modelos murinos de enfermedad pediátrica sigue siendo un reto. Los ratones que estados de enfermedad recién nacidos modelo son de tamaño insuficiente y el desarrollo inmaduro, y por lo tanto puede ser difícil de inyectar directamente en estructuras adecuadas en el SNC. Inyección intravascular de agentes terapéuticos es un método no invasivo, bien tolerado para entregar las células, fármacos, o vectores virales para todo el cuerpo, incluyendo el SNC y la retina 1-5 3,5-9. Publicaciones anteriores describen temporal inyección en la vena cara usando un transiluminador 10,11, sin un microscopio de disección 11,12, o que requieren dos personas para inyectar 10. La técnica de inyección descrito en este protocolo es ventajoso porque un solo individuo puede inyectar cachorros, y la fuente de luz para ver la vena temporal no está en contacto con el cachorro, eliminando la necesidad de cinta quirúrgica o la fijación de un cachorro a una superficie fijatal como un transiluminador 11. Entrega de adeno-asociado vector viral serotipo 9 (AAV9) en ratones produce sólida expresión en neuronas y astrocitos en todo el cerebro y la médula espinal (Figura 1). Entrega intravascular de vectores virales en la vena facial temporal superficial se ha utilizado de forma fiable en diversos estudios en ratones recién nacidos para tratar el trastorno neuromuscular pediátrica la atrofia muscular espinal (SMA) 2,4,13,14 y en última instancia el aumento de la vida útil de los ratones tratados.
Inyección intravascular de ratones neonatales también apunta eficazmente el sistema nervioso periférico y los órganos periféricos (Figura 2). Después de la inyección de AAV, la transducción de ganglios de la raíz dorsal, hígado, corazón, músculo esquelético, pulmón, y el plexo mientérico de la tripa se ha observado 1,3,6,7,15. Transducción generalizada del sistema nervioso central y la periferia hace que este método de inyección ideal para enfermedades que requieren expresión global deun transgén, como la enfermedad de 16 y otra de almacenamiento lisosomal enfermedades de Gaucher, la enfermedad de 17,18 Batten y ceroid lipofuscinoses neuronales relacionados, el 19 y el síndrome de Bardet-Biedl, un trastorno multisistémico genética con la aparición de los síntomas que se producen en la primera infancia 20. Inyección intravascular en ratones neonatal también debe ser considerado como un nuevo método de enfermedades pediátricas de todo el sistema de modelado. Esta técnica ha sido traducida a los modelos animales más grandes 5,21 y la inyección intravascular ya existe como un método clínicamente aceptable de la entrega de la terapéutica.
El actual protocolo describe un método simple y eficiente de suministro de agentes a ratones recién nacidos a través de la vena superficial cara temporal a más tardar el día postnatal 2. Inyección puede ser completado por una sola, practica individual y es bien tolerado por tanto las crías y las presas. Los cachorros experimentan angustia mínima y se recuperan rápidamente. Importantemente, la inyección exitosa resultará en la entrega global del agente administrado. Este protocolo es apropiado para la administración de vectores virales, agentes farmacéuticos o células a ratones recién nacidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entrega intravascular de agentes para el SNC o en todo el cuerpo es difícil en modelos murinos neonatales de la enfermedad. El protocolo descrito es una forma rápida, relativamente no invasiva para administrar por vía intravenosa soluciones en ratones recién nacidos con los requisitos mínimos de equipamiento. Aunque la vena cara temporal puede ser visto por el ojo desnudo, las inyecciones pueden tener una mayor precisión con el uso del microscopio y fuente de luz de fibra óptica, especialmente para un inyector si…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el NINDS, FightSMA y Familias de SMA para el apoyo financiero. Segl con el apoyo de la formación NINDS subvención # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Thinpro Insulin Syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10cc, 3/8" needle, 30G, 1 per mouse |
| Evans Blue Dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting Microscope |
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