זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף
Summary
ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.
Abstract
תאי גזע hematopoietic (HSCs) משמשים קליניים לטיפול בהשתלה כדי לבנות מחדש את מערכת hematopoietic של מטופל במחלות רבות כגון לוקמיה ולימפומה. הבהרת מנגנוני שליטה חידוש עצמי HSCs ובידול חשוב ליישום של HSCs למחקר ושימושים קליניים. עם זאת, לא ניתן לקבל כמות גדולה של HSCs בשל חוסר היכולת שלהם להתרבות במבחנה. כדי להתגבר על מכשול זה, היינו קו עצם עכבר מח שמקורן בתאים, שורת תאי EML (erythroid, מיאלואידית, ולימפוציטית), כמערכת מודל למחקר זה.
RNA-רצף (RNA-Seq) כבר בשימוש יותר ויותר כדי להחליף microarray ללימודי ביטוי גנים. אנו מדווחים כאן שיטה מפורטת של שימוש בטכנולוגית RNA-Seq כדי לחקור את גורמי מפתח הפוטנציאל ברגולציה של תא EML התחדשות עצמית והבחנה. הפרוטוקול הניתן במאמר זה מחולק לשלושה חלקים. הנקוב הראשוןלא מסביר כיצד תרבות תאי EML ונפרד לין-CD34 + ותאי לין-CD34-. החלק השני של הפרוטוקול מציע נהלים מפורטים להכנת RNA מוחלטת ובניית הספרייה העוקבת ברצף תפוקה גבוהה. החלק האחרון מתאר את השיטה לניתוח נתונים RNA-Seq ומסביר כיצד להשתמש בנתונים כדי לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן דיפרנציאלי בין לין-CD34 + ותאי לין-CD34-. גורמי השעתוק באופן משמעותי ביותר באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי זוהו להיות הרגולטורים המרכזיים פוטנציאל השליטה תא EML התחדשות עצמית והבחנה. בחלקו המסכם של מאמר זה, אנו מדגישים את השלבים העיקריים לביצוע מוצלח של ניסוי זה.
לסיכום, מאמר זה מציע שיטה של שימוש בטכנולוגית RNA-Seq לזהות רגולטורי פוטנציאל של התחדשות עצמית והבחנה בתאי EML. הגורמים המרכזיים שזוהו נתונים לאנליזה פונקציונלית במורד הזרם במבחנה ואניvivo n.
Introduction
תאי גזע hematopoietic הם תאי דם נדירים שמתגוררים בעיקר בנישה של מח העצם הבוגר. הם אחראים לייצור של תאים נדרשים כדי לחדש את הדם והמערכת החיסונית 1. כסוג של תאי גזע, HSCs מסוגל גם התחדשות עצמית והבחנה. הבהרת מנגנונים ששולטים בהחלטת גורלו של HSCs, כלפי שתי התחדשות עצמית או בידול, יציע הדרכה רבת ערך על המניפולציה של HSCs למחקר מחלת דם ושימוש קליני 2. אחת בעיות שעומדות בפני החוקרים היא שאפשר לקיים HSCs והרחיב במבחנה למידה מוגבלת מאוד; רובם המכריע של צאצאיהם נבדלים באופן חלקי בתרבות 2.
על מנת לזהות רגולטורים מרכזיים השולטים על התהליכים של התחדשות עצמית והבחנה בקנה מידת הגנום, שנהגנו קו עכבר פרימיטיווי hematopoietic תא אב EML כמערכת מודל. ההוא שורת תאים נגזרה מ3,4 מח עצם העכברי. כאשר נמאס עם גורמי גדילה שונים, תאי EML יכולים להתמיין erythroid, מיאלואידית, ותאי הלימפה במבחנה 5. חשוב לציין, את שורות תאים יכולים להיות מופצים בכמות גדולה במדיום התרבות המכיל גורם תאי גזע (SCF) ועדיין שמירת multipotentiality. ניתן להפריד תאי EML לאוכלוסיות משנה של-SCA לין העצמי חידוש + CD34 + ומובחנים באופן חלקי תאי לין-SCA-CD34- המבוססים על סמני משטח CD34 וSCA 6. בדומה לטווח קצר HSCs, SCA + CD34 + תאים מסוגלים התחדשות עצמית. כאשר טופל בSCF, לין-SCA + תאי CD34 + במהירות יכול להתחדש אוכלוסייה מעורבת של לין-SCA + תאי CD34 + ולין-SCA-CD34- וממשיך להתרבות 6. שתי האוכלוסיות דומות במורפולוגיה ויש רמות דומות של mRNA c-kit וחלבון 6. תאי לין-SCA-CD34- מסוגלים הפצת באמצעי תקשורת המכילה IL-3 במקום SCF 3. Unveilinז הרגולטורים המרכזיים בהחלטת גורל תא EML תציע הבנה טובה יותר של מנגנונים תאיים ומולקולריים במעבר התפתחותי מוקדם במהלך hematopoiesis.
על מנת לחקור את ההבדלים מולקולריים שבבסיס בין-SCA לין העצמי חידוש + CD34 + ותאי לין-SCA-CD34- מובחנים באופן חלקי, היינו RNA-Seq לזיהוי גנים הביעו באופן דיפרנציאלי. בפרט, אנו מתמקדים בגורמי שעתוק, כגורמי שעתוק הם קריטיים בקביעת גורל תא. RNA-Seq הוא גישה שפותחה לאחרונה שמנצלת את היכולות של רצף הדור הבא טכנולוגיות (NGS) לפרופיל ולכמת RNAs עיבד מהגנום 7,8. בקיצור, רנ"א הכל הוא poly-נבחרים ומקוטע כתבנית template.The RNA הראשונית ולאחר מכן הוסבה לcDNA באמצעות טרנסקריפטאז ההפוך. על מנת למפות תעתיקי רנ"א באורך מלא, באמצעות RNA שלם, שאינו מושפל לבניית ספריית cDNA הוא חשוב. לPURפוזה של רצף, רצפי מתאם ספציפיים מתווספים לשני הקצוות של cDNA. ואז, ברוב המקרים, מולקולות cDNA הם מוגברים על ידי PCR והרצף באופן תפוקה גבוהה.
לאחר רצף, התוצאה כך קורא יכולה להיות מיושרת לגנום התייחסות ומסד נתוני transcriptome. מספר קורא את המפה לגן ההתייחסות נספרו, ומידע זה יכול לשמש כדי להעריך את רמת ביטוי הגן. קורא גם יכול להיות התאסף דה נובו ללא הגנום התייחסות, המאפשר המחקר של transcriptomes באורגניזמים שאינם מודל 9. טכנולוגית RNA-seq שימשה גם כדי לזהות isoforms אחוי 10-12, תמלילי רומן 13 ושילובי גן 14. בנוסף לזיהוי של גני המקודדים חלבונים, RNA-Seq יכול גם לשמש כדי לזהות רומן ולנתח ברמת שעתוק של RNA קידוד שאינו, כגון ארוך ללא קידוד 15,16 RNA, microRNA 17, siRNA וכו '18. בגלל tהוא הדיוק של שיטה זו, זה נוצל לצורך זיהוי של וריאציות נוקלאוטיד בודדות 19,20.
לפני הופעתו של טכנולוגיית RNA-Seq, microarray היה השיטה העיקרית המשמשת לניתוח פרופיל ביטוי גנים. בדיקות תוכנן מראש מסונתזות ולאחר מכן מחוברת למשטח מוצק ליצירת שקופיות microarray 21. mRNA מופק והמיר לcDNA. במהלך תהליך השעתוק לאחור, נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently משולבים cDNA וcDNA יכול להיות הכלאה על שקופיות microarray. עוצמת האות שנאספו מנקודה מסוימת תלויה בכמות של cDNA מחייבת הבדיקה הספציפית באותו האזור 21. לעומת טכנולוגית RNA-Seq, יש microarray מספר מגבלות. ראשית, microarray מסתמך על הידע קיים מראש של ביאור גן, תוך טכנולוגית RNA-Seq היא מסוגלת לזהות תמלילי רומן ברמה היחסית גבוהה רקע, המגבילה את השימוש בו, כאשר GEרמת ביטוי ne היא נמוכה. חוץ מזה, יש לו את הטכנולוגיה RNA-Seq הרבה יותר גבוה טווח דינמי של זיהוי (8,000 לקפל) 7, ואילו, בשל רקע ורוויה של אותות, את הדיוק של microarray הוא מוגבל לשני הגנים הביעו מאוד ונח 7,22. לבסוף, בדיקות microarray שונות ביעילות ההכלאה שלהם, ההופכת את התוצאות פחות אמינות כאשר משווים רמות ביטוי היחסית של תעתיקים שונים בתוך דגימה אחת 23. למרות שיש RNA-Seq יתרונות רבים על פני microarray, ניתוח הנתונים שלה הוא מורכב. זה אחת הסיבות שחוקרים רבים עדיין משתמשים microarray במקום RNA-Seq. כלים ביואינפורמטיקה שונים הנדרשים לעיבוד נתונים RNA-Seq וניתוח 24.
בין כמה רצפים של הדור הבא פלטפורמות (NGS), 454, Illumina, Torrent מוצק והיון הם אלה בשימוש נרחב ביותר. 454 היו פלטפורמת NGS המסחרית הראשונה. בניגוד לפלטפורמות רצף האחריםאורך כגון Illumina ומוצק, הפלטפורמה 454 מייצרת לקרוא יותר (בסיס 700 ממוצע כניסות) 25. עוד קורא טוב יותר לאפיון ראשוני של transcriptiome בשלהם גבוהים יותר להרכיב את יעילות 25. החסרון העיקרי של הפלטפורמה 454 הוא העלות הגבוהה שלה לmegabase של רצף. Illumina והפלטפורמות מוצקים לייצר קוראים עם מספרים מוגברים ואורכים קצרים. העלות לmegabase של רצף היא נמוכה בהרבה מהפלטפורמה 454. בשל המספר הגדול של קצר קורא לIllumina ופלטפורמות מוצקים, ניתוח נתונים הוא הרבה יותר אינטנסיבי המחשוב. מחירו של המכשיר וריאגנטים עבור סידור עבור פלטפורמת Ion Torrent הוא זול יותר וזמן רצף קצר יותר 25. עם זאת, שיעור השגיאה ואת העלות לmegabase של רצף נמצאים גבוהה יותר בהשוואה לIllumina ופלטפורמות מוצקה. יש פלטפורמות שונות יתרונות וחסרונות משל ודורשות שיטות שונות לניתוח נתונים. PLAיש לבחור tform המבוסס על מטרת הרצף ואת הזמינות של מימון.
במאמר זה, אנחנו לוקחים את פלטפורמת Illumina RNA-Seq כדוגמא. אנחנו השתמשנו תא EML כמערכת מודל כדי לחקור את הרגולטורים המרכזיים בתא התחדשות עצמית EML ובידול, וסיפקנו שיטות מפורטות של בניית RNA-Seq ספרייה וניתוח נתונים לחישוב רמת ביטוי וגילוי תמליל רומן. שהראינו בפרסום הקודם שלנו שמחקר RNA-seq במערכת מודל EML 2, כאשר בשילוב עם בדיקה פונקציונלית (לדוגמא מציאה shRNA) מספק גישה חזקה בהבנת המנגנון המולקולרי של המוקדמים של בידול hematopoietic השלבים, ויכולים לשמש כ מודל לניתוח של תא התחדשות עצמית והבחנה באופן כללי.
Protocol
Representative Results
Discussion
transcriptome יונקים היא מאוד מורכבת 34-38. טכנולוגית RNA-Seq משחקת תפקיד חשוב יותר ויותר במחקרים של ניתוח transcriptome, גילוי תמלילי רומן וגילוי הווריאציה נוקלאוטיד הבודד וכו 'יש לו יתרונות רבים על פני שיטות אחרות לניתוח ביטוי גנים. כפי שהוזכר ב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
Referências
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
- Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
- Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
- Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
- Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
- Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361 (2012).
- Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689 (2013).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
- Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
- Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6 (2011).
- Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
- Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
- Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16 (2010).
- Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106 (2009).
- Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307 (2013).
- Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
- Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567 (2013).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
- Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
- Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
- Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
- Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
- Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
- Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
- Wu, J. . Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).
