Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse
Summary
RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.
Abstract
Hematopoietische stamcellen (HSC) worden klinisch gebruikt voor transplantatie behandeling hematopoëtische systeem van een patiënt bouwen bij vele ziekten zoals leukemie en lymfoom. Ophelderen van de mechanismen die HSCs zelfvernieuwing en differentiatie is belangrijk voor de toepassing van HSCs voor onderzoek en klinische toepassingen. Het is echter niet mogelijk om grote hoeveelheden van HSCs hetzij vanwege hun onvermogen tot prolifereren in vitro. Om deze hindernis te overwinnen, hebben we gebruik gemaakt van een muis beenmerg afgeleide cellijn, de EML (erythroïde, myeloïde en lymfatische) cellijn, als een modelsysteem voor de studie.
RNA-sequencing (RNA-Seq) wordt in toenemende mate gebruikt om microarray voor genexpressie studies vervangen. Wij rapporteren hier een gedetailleerde methode waarbij RNA-Seq technologie het potentieel belangrijke factoren bij de regulering van EML cel zelfvernieuwing en differentiatie te onderzoeken. Het protocol in dit papier is verdeeld in drie delen. De eerste part wordt uitgelegd hoe u de cultuur EML cellen en aparte Lin-CD34 + en Lin-CD34-cellen. Het tweede deel van het protocol biedt gedetailleerde procedures voor de totale RNA-bereiding en de daaropvolgende bibliotheek constructie voor high-throughput sequencing. Het laatste deel beschrijft de methode voor het RNA-Seq data-analyse en wordt uitgelegd hoe u de gegevens gebruiken om differentieel tot expressie transcriptiefactoren tussen Lin-CD34 + en Lin-CD34 cellen te identificeren. Het meest significant verschillend tot expressie transcriptiefactoren werden geïdentificeerd aan de potentiële sleutel regulatoren controleren van EML cel zelfvernieuwing en differentiatie zijn. In de discussie sectie van dit document, hebben we aandacht voor de belangrijkste stappen voor een succesvolle uitvoering van dit experiment.
Kortom, dit document biedt een methode waarbij RNA-Seq technologie mogelijke regulatoren van zelfvernieuwing en differentiatie in EML cellen te identificeren. De vastgestelde sleutelfactoren zijn onderworpen aan downstream functionele analyse in vitro pt in vivo.
Introduction
Hematopoietische stamcellen zijn zeldzaam bloedcellen die vooral in de volwassen beenmerg niche wonen. Zij zijn verantwoordelijk voor de productie van cellen nodig is om de bloed vullen en het immuunsysteem 1. Als een soort van stamcellen, HSCs kunnen zowel zelfvernieuwing en differentiatie. Ophelderen van de mechanismen die het lot beslissing van HSC's te beheersen, in de richting van ofwel zelf-vernieuwing of differentiatie, zal een waardevolle leidraad bieden aan de manipulatie van HSC voor bloedziekte onderzoeken en klinische gebruik 2. Een probleem van de onderzoekers dat HSCs kunnen worden gehandhaafd en geëxpandeerd in vitro in zeer beperkte mate; de meeste afstammelingen gedeeltelijk gedifferentieerd in kweek 2.
Om de belangrijkste toezichthouders dat de processen van zelf-vernieuwing en differentiatie te controleren op een genoom-brede schaal te identificeren, hebben we gebruik gemaakt van een muis primitieve hematopoietische voorlopercellen cellijn EML als modelsysteem. Thwordt cellijn werd afgeleid van muizen beenmerg 3,4. Wanneer gevoed met verschillende groeifactoren kunnen EML cellen differentiëren tot erythroïde, myeloïde en lymfoïde cellen in vitro 5. Belangrijk is, kan deze cellijn worden gekweekt in grote hoeveelheid in kweekmedium met stamcel factor (SCF) en het behoud van hun multipotentiality. EML cellen kunnen worden gescheiden in subpopulaties van zelf-vernieuwing Lin-SCA + CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerde Lin-SCA-CD34- cellen op basis van oppervlakte markers CD34 en SCA 6. Net als bij de korte termijn HSC, SCA + CD34 + cellen zijn in staat van zelf-vernieuwing. Bij behandeling met SCF, Lin-SCA + CD34 + cellen snel kan regenereren een gemengde populatie van Lin-SCA + CD34 + en Lin-SCA-CD34- cellen en blijven prolifereren 6. De twee populaties zijn vergelijkbaar in morfologie en hebben vergelijkbare niveaus van c-kit mRNA en eiwit 6. Lin-SCA-CD34- cellen kunnen voortplanten in medium dat IL-3 in plaats van SCF 3. Unveiling de belangrijkste toezichthouders in de EML Celgedrag zal beter begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen bieden in vroege ontwikkelingsstoornissen overgang tijdens hematopoiesis.
Om de onderliggende moleculaire verschillen tussen de zelf-vernieuwing Lin-SCA + CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerde Lin-SCA-CD34- cellen te onderzoeken, gebruikten we RNA-Seq differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren. In het bijzonder richten we ons op transcriptiefactoren, zoals transcriptiefactoren zijn cruciaal bij het bepalen lot van de cel. RNA-Seq is een recent ontwikkelde aanpak die de mogelijkheden van de next-generation sequencing gebruikt (NGS) technologieën te profileren en te kwantificeren RNA getranscribeerd uit genoom 7,8. In het kort, totaal RNA poly-A geselecteerd en gefragmenteerd met de eerste template.The RNA matrijs wordt vervolgens omgezet in cDNA met behulp van reverse transcriptase. Om in kaart volledige lengte RNA transcripten, met intacte, niet-afgebroken RNA voor het construeren van cDNA-bibliotheek is belangrijk. Voor de purstelt van sequencing worden specifieke adapter sequenties toegevoegd aan beide uiteinden van cDNA. Vervolgens, in de meeste gevallen cDNA moleculen worden geamplificeerd door PCR en sequentie in een high-throughput manier.
Na sequencing, het resulterende leest kan worden afgestemd om een referentie genoom en een transcriptome database. Het aantal staat dat de kaart aan de referentie-gen wordt geteld en deze informatie kan worden gebruikt om genexpressie kan worden gemeten. De leest kan worden gemonteerd zonder de novo referentie genoom, waardoor de studie van transcriptomes in niet-modelorganismen 9. RNA-seq technologie is ook gebruikt voor splice isovormen 10-12, nieuwe transcripten 13 en genfusies 14 detecteren. Naast de detectie van eiwit-coderende genen, kunnen RNA-Seq ook worden gebruikt om nieuwe transcriptieniveau van niet-coderende RNA's, zoals detecteren en analyseren van lange niet-coderende RNA 15,16, microRNA 17, siRNA etc. 18. Vanwege thij nauwkeurigheid van deze methode, is gebruikt voor de detectie van enkelvoudige nucleotide variaties 19,20.
Vóór de komst van de RNA-Seq-technologie, microarray was de belangrijkste methode die wordt gebruikt voor de analyse van genexpressie-profiel. Vooraf ontworpen probes worden gesynthetiseerd en vervolgens bevestigd aan een vast oppervlak op een microarray dia 21 vormen. mRNA wordt geëxtraheerd en omgezet in cDNA. Tijdens het reverse transcriptie proces worden fluorescent gelabelde nucleotiden opgenomen in het cDNA en de cDNA kan worden gehybridiseerd op de microarray dia. De intensiteit van het vanuit een specifieke plek signaal afhankelijk van de hoeveelheid cDNA binding aan de specifieke probe op die plek 21. In vergelijking met RNA-Seq-technologie, micro-array heeft een aantal beperkingen. Eerste microarray gebaseerd op de reeds bestaande kennis van gen annotatie, terwijl RNA-Seq technologie kan nieuwe transcripten detecteren relatief hoog achtergrondniveau, die het gebruik ervan bij beperkt gene uitdrukking niveau is laag. Bovendien, de RNA-Seq technologie veel hoger dynamisch bereik van detectie (8000 voudig) 7, dat, als gevolg van achtergrondlicht en verzadiging van de signalen, de nauwkeurigheid van microarray beperkt zowel sterk en bescheiden expressie gebrachte genen 7,22. Tenslotte microarray sondes verschillen in hun hybridisatie efficiëntie, waarin de resultaten minder betrouwbaar maken bij het vergelijken van de relatieve expressie niveaus van verschillende transcripts binnen één monster 23. Hoewel RNA-Seq veel voordelen heeft boven microarray, de data analyse complex. Dit is een van de redenen dat veel onderzoekers nog steeds gebruik van microarray in plaats van RNA-Seq. Verschillende bioinformatica nodig voor RNA-Seq data en analyse 24.
Onder verschillende next-generation sequencing (NGS) platforms, 454, Illumina, SOLID en Ion Torrent zijn de meest gebruikte plaatsen. 454 was de eerste commerciële NGS platform. In tegenstelling tot de andere sequencing platformszoals Illumina en SOLID, genereert de 454-platform meer lezen lengte (gemiddeld 700 base gelezen) 25. Langere leest zijn beter voor eerste karakterisering van transcriptiome vanwege de hogere efficiëntie monteren 25. Het belangrijkste nadeel van het platform 454 is de hoge kosten per megabase sequentie. De Illumina en SOLID platforms genereren leest met verhoogde aantallen en korte lengtes. De kosten per megabase sequentie is veel lager dan de 454 platform. Vanwege het grote aantal korte leest de Illumina SOLID platforms, gegevensanalyse veel computerintensief. De prijs van het instrument en reagentia voor sequencing voor de Ion Torrent platform is goedkoper en de sequencing is korter 25. Echter, het aantal fouten en de kosten per megabase van sequence zijn hoger in vergelijking met de Illumina en SOLID platforms. Verschillende platforms hebben hun eigen voordelen en nadelen en vereisen verschillende methoden voor gegevensanalyse. De plaTForm moet worden gekozen op basis van de sequencing doel en de beschikbaarheid van financiële middelen.
In dit artikel nemen we Illumina RNA-Seq platform als voorbeeld. We gebruikten EML cel als modelsysteem om de belangrijkste toezichthouders in EML cel zelfvernieuwing en differentiatie te onderzoeken, en op voorwaarde dat een gedetailleerde methoden voor RNA-Seq bibliotheek bouw en de data-analyse voor expressie niveau berekening en nieuwe transcript detectie. We hebben aangetoond in onze eerdere publicatie die RNA-seq studie EML modelsysteem 2, wanneer gekoppeld aan functionele test (bijvoorbeeld shRNA knockdown) een krachtige aanpak in het begrijpen van de moleculaire mechanismen van de vroege stadia van hematopoëtische differentiatie en kan dienen als een model voor analyse van cel zelfvernieuwing en differentiatie in het algemeen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zoogdieren transcriptome is zeer complex 34-38. RNA-Seq-technologie speelt een steeds belangrijkere rol in de studies van transcriptoomanalyse, roman transcripties detectie en single nucleotide variatie discovery enz. Het heeft vele voordelen ten opzichte van andere methoden voor de analyse van genexpressie. Zoals vermeld in de inleiding, overwint de hybridisatie artefacten van microarray en kan worden gebruikt om nieuwe transcripten de novo identificeren. Een beperking van RNA-sequen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
Referências
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
- Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
- Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
- Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
- Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
- Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361 (2012).
- Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689 (2013).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
- Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
- Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6 (2011).
- Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
- Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
- Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16 (2010).
- Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106 (2009).
- Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307 (2013).
- Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
- Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567 (2013).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
- Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
- Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
- Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
- Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
- Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
- Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
- Wu, J. . Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).
