Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Summary

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Abstract

As células estaminais hematopoiéticas (HSCs) são utilizados clinicamente para o tratamento de transplante para reconstruir o sistema hematopoiético de um paciente em muitas doenças, tais como leucemia e linfoma. Elucidação dos mecanismos que controlam HSCs auto-renovação e diferenciação é importante para a aplicação de HSCs para a pesquisa e usos clínicos. No entanto, não é possível obter grande quantidade de HSCs, devido à sua incapacidade para proliferar in vitro. Para superar este obstáculo, foi utilizada uma linha de células derivadas da medula óssea do rato, a linhagem de células EML (eritróide, mielóide e linfóide), como um sistema modelo para este estudo.

RNA-seqüenciamento (RNA-Seq) tem sido cada vez mais usado para substituir microarray para estudos de expressão gênica. Nós relatamos aqui um método detalhado do uso da tecnologia de RNA-Seq para investigar os possíveis fatores-chave na regulação da célula EML auto-renovação e diferenciação. O protocolo fornecido neste artigo está dividido em três partes. O primeiro part explica como a cultura de células de EML e separado Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. A segunda parte do protocolo oferece procedimentos detalhados para a preparação total de RNA ea construção da biblioteca para posterior de alto rendimento de sequenciamento. A última parte descreve o método para análise de dados de RNA-Seq e explica como usar os dados para identificar fatores de transcrição diferencialmente expressos entre Lin-CD34 + e células Lin-CD34 @. Os fatores de transcrição mais significativamente diferencialmente expressos foram identificados como sendo os possíveis reguladores chave que controlam as células EML auto-renovação e diferenciação. Na discussão deste trabalho, destacamos as principais etapas para um desempenho de sucesso desta experiência.

Em resumo, este trabalho oferece um método de usar a tecnologia de RNA-Seq para identificar potenciais reguladores de auto-renovação e diferenciação em células EML. Os principais fatores identificados são submetidos à análise funcional jusante in vitro e in vivo.

Introduction

As células estaminais hematopoiéticas são células sanguíneas raras que residem principalmente no nicho da medula óssea de adultos. Eles são responsáveis ​​pela produção de células necessárias para a reconstituição do sangue e os sistemas imunitários ^1. Como um tipo de células estaminais, HSCs são capazes de tanto a auto-renovação e diferenciação. Elucidar os mecanismos que controlam a decisão destino de HSCs, direção ou auto-renovação ou diferenciação, vai oferecer orientações valiosas sobre a manipulação de HSCs para pesquisas de doenças de sangue e uso clínico ^2. Um problema enfrentado pelos pesquisadores é que HSCs podem ser mantidas e expandidas in vitro de forma muito limitada; a grande maioria dos seus descendentes são parcialmente diferenciadas em cultura ^2.

A fim de identificar os principais reguladores que controlam os processos de auto-renovação e diferenciação em uma escala de todo o genoma, foi utilizada uma linha primitiva de células progenitoras hematopoiéticas do rato EML como um sistema modelo. Thé A linha celular foi derivada a partir de ^3,4 medula óssea de murino. Quando alimentados com diferentes factores de crescimento, as células podem diferenciar-se em EML eritróide, mielóide, e células linfóides in vitro, ^5. É importante notar que esta linhagem celular pode ser propagada em grande quantidade no meio de cultura contendo factor de células estaminais (SCF) e ainda reter a sua multipotencialidade. Células EML podem ser separados em subpopulações de auto-renovação Lin-SCA + CD34 + e parcialmente diferenciadas células Lin-SCA-CD34 @ com base em marcadores de superfície CD34 e SCA ^6. Semelhante a curto prazo HSCs, SCA + CD34 + células são capazes de auto-renovação. Quando tratados com células CD34 + SCF, Lin-SCA + pode regenerar rapidamente uma população mista de células CD34 + e Lin-SCA-CD34 @ Lin-SCA + e continuam a proliferar ^6. As duas populações são semelhantes na morfologia e têm níveis semelhantes de ARNm de c-kit e proteína ^6. Células Lin-SCA-CD34 @ são capazes de propagar em meios contendo IL-3 em vez de SCF ^3. Unveiling principais reguladores da EML decisão destino celular vai oferecer melhor compreensão dos mecanismos celulares e moleculares em transição inicial de desenvolvimento durante a hematopoiese.

A fim de investigar as diferenças moleculares subjacentes entre a auto-renovação de células Lin-SCA-CD34 @ parcialmente diferenciados Lin-SCA + CD34 + e, usamos RNA-Seq para identificar genes diferencialmente expressos. Em particular, vamos nos concentrar em fatores de transcrição, como fatores de transcrição são cruciais na determinação do destino da célula. RNA-Seq é uma abordagem desenvolvida recentemente, que utiliza as capacidades de sequenciamento de próxima geração (NGS) tecnologias para o perfil e quantificar RNAs transcritos do genoma ^7,8. Em resumo, o ARN total é poli-A e fragmentada seleccionado como o modelo template.The ARN inicial é então convertido em cDNA usando transcriptase reversa. De modo a mapear full-length transcritos de ARN, utilizando, ARN não degradado intacta para a construção da biblioteca de cDNA é importante. Para o purrepresentar de sequenciamento, as sequências adaptadoras específicos são adicionados a ambas as extremidades do cDNA. Em seguida, na maioria dos casos, as moléculas de ADNc são amplificados por PCR e sequenciado de uma forma de alto rendimento.

Após o seqüenciamento, a resultante leituras podem ser alinhados com um genoma de referência e um banco de dados de transcriptoma. O número de leituras que mapeiam para o gene de referência é contada e essa informação pode ser usada para estimar o nível de expressão do gene. A lê também podem ser montados, de novo sem um genoma de referência, permitindo que o estudo de transcriptomes em organismos modelo ^não-9. Tecnologia de RNA-seq também tem sido usado para detectar as isoformas de splicing, ^10-12 novos transcritos ¹³ e ¹⁴ fusões de genes. Em adição à detecção de genes codificadores de proteínas, o RNA-Seq também pode ser usada para detectar e analisar romance nível de transcrição de RNAs não-codificantes, tais como longa não codificante de ARN ^15,16, microARN ^{17, 18,} ​​etc siRNA. Por causa de tele precisão deste método, tem sido utilizado para a detecção de variações de nucleótidos simples ^19,20.

Antes do advento da tecnologia de RNA-Seq, microarray foi o principal método utilizado para analisar o perfil de expressão do gene. Pré-concebidas sondas são sintetizados e subsequentemente ligado a uma superfície sólida para formar uma lâmina de microarray ^21. ARNm é extraído e convertido em cDNA. Durante o processo de transcrição reversa, os nucleótidos marcados com fluorescência são incorporados no cDNA e o cDNA pode ser hibridado nas lâminas de microarray. A intensidade do sinal recolhido a partir de um ponto específico depende da quantidade de ADNc de ligação com a sonda específica naquele ponto ^21. Em comparação com a tecnologia de RNA-Seq, microarray tem várias limitações. Primeiro, microarray confia no conhecimento pré-existente de anotação de genes, enquanto a tecnologia de RNA-Seq é capaz de detectar novas transcrições em alto nível de fundo relativa, o que limita a sua utilização quando a GEnível de expressão ne é baixo. Além disso, a tecnologia de RNA-Seq tem muito maior alcance dinâmico de detecção (8.000 vezes) ^7, que, devido ao fundo e saturação dos sinais, a precisão de microarray é limitado para ambos os genes altamente expressos e humilde ^7,22. Finalmente, as sondas de microarranjo diferem em suas eficiências de hibridização, que tornam os resultados menos confiáveis ​​quando se comparam os níveis de expressão relativos de diferentes transcritos dentro de uma amostra de ^23. Embora RNA-Seq tem muitas vantagens sobre microarranjo, a análise de dados é complexo. Esta é uma das razões que muitos pesquisadores ainda usam microarray em vez de RNA-Seq. Várias ferramentas de bioinformática são necessários para o processamento de dados de RNA-Seq e análise ^24.

Entre vários sequenciamento de próxima geração (NGS) plataformas, 454, Illumina, SOLID e Ion Torrent são os mais utilizados. 454 foi a primeira plataforma de NGS comercial. Em contraste com as outras plataformas de sequenciaçãocomprimento como illumina e sólida, a plataforma 454 gera mais ler (em média 700 base de leituras) ^25. Lê mais são melhores para a caracterização inicial de transcriptiome devido à sua maior eficiência montar ^25. A principal desvantagem da plataforma 454 é o seu custo elevado por megabases de sequência. A Illumina e plataformas SÓLIDOS gerar lê com aumento e comprimentos curtos. O custo por megabases de sequência é muito mais baixa do que a plataforma 454. Devido ao grande número de curta lê para a Illumina e plataformas SÓLIDOS, análise de dados é muito mais computacionalmente intensivo. O preço do instrumento e reagentes para sequenciamento para a plataforma Ion Torrent é mais barato eo tempo de seqüenciamento é mais curto ^25. No entanto, a taxa de erro e o custo por megabases de sequência são mais elevados em comparação com o Ilumina e plataformas SÓLIDOS. Plataformas diferentes têm suas próprias vantagens e desvantagens e exigem métodos diferentes para análise de dados. O plaTForm deve ser escolhido com base na finalidade de seqüenciamento e da disponibilidade de financiamento.

Neste artigo, tomamos plataforma Illumina RNA-Seq como um exemplo. Utilizou-se EML célula como um sistema modelo para investigar os reguladores-chave na EML celular auto-renovação e diferenciação, e fornecida uma métodos detalhados de construção da biblioteca de ARN-Seq e análise de dados para o cálculo do nível de expressão e detecção de novo transcrito. Temos mostrado na nossa publicação anterior que estudo RNA-seq no sistema modelo EML ^2, quando acoplado com teste funcional (por exemplo, shRNA knockdown) proporcionar uma abordagem poderosa para compreender o mecanismo molecular dos primeiros estágios de diferenciação hematopoiética, e pode servir como um modelo para a análise de células de auto-renovação e diferenciação em geral.

Protocol

1. EML cultura de células e separação das células CD34 + Lin-Lin e-CD34 @ Usar celular Magnetic Classificando Sistema e fluorescência-ativado celular método de classificação Preparação de bebê de rim de hamster (BHK) meio de cultura de células-tronco para coleta de fator de célula: Cultura de células BHK em meio DMEM contendo 10% de FBS em balão de 25cm 2 (Tabela 1), a 37 ° C, 5% de CO 2 num incubador de cultura de células. Quando as c…

Representative Results

A fim de analisar os genes diferencialmente expressos em Lin-CD34 + e CD34- células Lin-EML, usamos a tecnologia de RNA-Seq. A Figura 1 mostra o fluxo dos procedimentos. Após o isolamento das células de linhagem negativos por separação de células magnéticas, nós separamos as células Lin-SCA-CD34 @ usando FACS Aria Lin-SCA + CD34 + e. Células EML Lin enriquecidas foram marcadas com anti-CD34, anti-Sca1 e anticorpos cocktail de linhagem. Apenas as células Lin- foram fechado para a análise de S…

Discussion

Transcriptoma de mamíferos é muito complexo ^34-38. Tecnologia de RNA-Seq desempenha um papel cada vez mais importante nos estudos de análise de transcriptoma, novela de detecção de transcrições e único nucleotídeo descoberta variação etc. Ele tem muitas vantagens sobre outros métodos de análise de expressão gênica. Como mencionado na introdução, que supera os artefactos de hibridação de microarray e pode ser utilizado para identificar novos transcritos de de novo. U…

Materials

Antibiotic-Antimycotic	Invitrogen	15240-062	BHK cell culture
Anti-Mouse CD34 FITC	eBioscience	11-0341-81	FACS sorting
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE	eBioscience	12-5981-81	FACS sorting
APC Mouse Lineage Antibody Cocktail	BD Biosciences	558074	FACS sorting
BD FACSAria Cell Sorter	BD Biosciences	Special offer sysmtem	FACS sorting
Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2	Corning incorporated	430641	Cell culture
Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2	Corning incorporated	430639	Cell culture
Deoxyribonuclease I, Amplification Grade	Invitrogen	18068-015	Library preparation
DMEM	Invitrogen	11965-092	BHK cell culture
DPBS	Gibco	14190	Cell culture
HI FBS	Invitrogen	16140071	BHK cell culture
Horse Serum	Invitrogen	16050-122	EML cell culture
IMDM	HyClone	SH30228.02	EML cell culture
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081	Cell culture
Lineage Cell Depletion Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-090-858	Isolation of lineage negative cells
NanoVue Plus spectrophotometer	GE Healthcare	28-9569-62	Quality control
Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators	Thermo Scientific	15-497-002	Cell culture
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122	EML cell culture
TRIzol® Reagent	Invitrogen	15596-018	RNA exraction
TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn)	Illumina	RS-122-2002	Library preparation
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939AA	Quality control
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200	Cell culture
0.45 µm Syringe Filters	Nalgene	190-2545	Cell culture