تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل
Summary
استخدمت RNA-التسلسل والتحليلات المعلوماتية الحيوية لتحديد عوامل النسخ أعرب كبير وبشكل مختلف في لين-CD34 + ولين CD34- القطعان من EMLcells الماوس. هذه عوامل النسخ قد تلعب أدوارا مهمة في تحديد التبديل بين الخلايا لين لين CD34–CD34 + ومتباينة جزئيا تجديد الذات.
Abstract
وتستخدم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) سريريا للعلاج زرع لإعادة بناء نظام المكونة للدم المريض في العديد من الأمراض مثل سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية. توضيح آليات السيطرة HSCs تجديد الذات والتمايز المهم للتطبيق HSCs للبحوث واستخدامات السريرية. ومع ذلك، فإنه من غير الممكن الحصول على كمية كبيرة من HSCs بسبب عدم قدرتها على التكاثر في المختبر. للتغلب على هذه العقبة، استخدمنا خط خلية نخاع المستمدة الماوس العظام، وقائمة الأدوية الأساسية (محمر، متعلق بالنخاع الشوكي، والليمفاوي) خط الخلية، كنظام نموذج لهذه الدراسة.
RNA-التسلسل (RNA تسلسل) قد استخدمت على نحو متزايد ليحل محل ميكروأري للدراسات التعبير الجيني. نحن هنا تقرير مفصل لطريقة استخدام التكنولوجيا-RNA بعدها للتحقيق في العوامل الرئيسية المحتملة في تنظيم خلية EML تجديد الذات والتمايز. وينقسم البروتوكول المقدمة في هذه الورقة إلى ثلاثة أجزاء. على قدم المساواة الأولر يشرح كيفية الثقافة خلايا EML، وفصل لين-CD34 + والخلايا لين CD34-. الجزء الثاني من البروتوكول يوفر إجراءات مفصلة لمجموع RNA إعداد وبناء مكتبة لاحق الإنتاجية العالية التسلسل. ويصف الجزء الأخير طريقة لتحليل البيانات RNA وبعدها يشرح كيفية استخدام البيانات لتحديد عوامل النسخ أعرب تفاضلي بين لين-CD34 + والخلايا لين CD34-. تم تحديد عوامل النسخ الأهم أعرب تفاضلي أن المنظمين الرئيسيين المحتملين السيطرة على خلية EML تجديد الذات والتمايز. في قسم مناقشة هذه الورقة، ونحن تسليط الضوء على الخطوات الرئيسية للأداء الناجح لهذه التجربة.
وباختصار، فإن هذه الورقة تقدم طريقة استخدام التكنولوجيا لتحديد تسلسل الحمض النووي الريبي التنظيمية المحتملة لتجديد الذات والتمايز في الخلايا EML. تتعرض العوامل الرئيسية المحددة لتحليل وظيفي المصب في المختبر وأنان الجسم الحي.
Introduction
الخلايا الجذعية المكونة للدم هي خلايا الدم النادرة التي يقيمون بصورة رئيسية في نخاع عظم مكانة الكبار. أنها هي المسؤولة عن إنتاج الخلايا المطلوبة لتجديد الدم والجهاز المناعي 1. كنوع من الخلايا الجذعية، HSCs قادرون على حد سواء تجديد الذات والتمايز. توضيح الآليات التي تتحكم في قرار مصير HSCs، إما نحو التجديد الذاتي أو التمايز، سوف نقدم توجيهات قيمة بشأن التلاعب HSCs لأبحاث أمراض الدم والاستخدام السريري 2. واحد المشكلة التي يواجهها الباحثون هي أن HSCs يمكن الحفاظ على وتوسعت في المختبر على نطاق محدود جدا. ويفرق الغالبية العظمى من ذريتها جزئيا في الثقافة 2.
من أجل تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية التي تتحكم في عمليات تجديد الذات والتمايز على نطاق الجينوم واسعة، وكنا ماوس البدائية المكونة للدم خط خلية سلفية EML كنظام نموذج. عشروتم اشتقاق خط خلية من الفئران نخاع العظم 3،4. عندما تتغذى على عوامل النمو المختلفة، يمكن أن تفرق في خلايا EML محمر، النخاعي، والخلايا اللمفاوية في المختبر 5. الأهم من ذلك، يمكن نشر هذا خط الخلية بكميات كبيرة في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على الخلايا الجذعية عامل (SCF) والإبقاء على تعدد الإمكانيات التي لا يزال. يمكن فصل الخلايا EML إلى مجموعات سكانية فرعية من تجديد الذات لين-SCA + CD34 + وتختلف جزئيا خلايا لين-SCA-CD34- على أساس علامات السطحية CD34 وSCA 6. على غرار المدى القصير HSCs، SCA + CD34 + الخلايا قادرة على تجديد الذات. عندما تعامل مع SCF، لين-SCA خلايا CD34 + + يمكن أن تتجدد بسرعة اختلط فيها لين-SCA خلايا CD34 + + ولين-SCA-CD34- وتستمر في التكاثر 6. السكان متشابهان في التشكل ولها مستويات مماثلة من مرنا ج-طقم 6 والبروتين. خلايا لين-SCA-CD34- قادرة على نشر في وسائل الإعلام التي تحتوي على IL-3 بدلا من SCF 3. Unveilinز المنظمين الرئيسيين في قرار مصير خلية EML سوف نقدم فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية في التحول التنموي في وقت مبكر خلال الدم.
من أجل التحقيق في الخلافات الجزيئية الكامنة بين تجديد الذات لين-SCA + CD34 + وخلايا متباينة جزئيا لين-SCA-CD34-، استخدمنا تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد الجينات وأعرب تفاضلي. على وجه الخصوص، ونحن نركز على عوامل النسخ، وعوامل النسخ حاسمة في تحديد مصير الخلية. تسلسل الحمض النووي الريبي هو نهج وضعت مؤخرا والتي تستخدم قدرات الجيل القادم التسلسل (خ ع) تقنيات للصفحة الشخصية وتحديد الرنا كتب من الجينوم 7،8. باختصار، هو الحمض النووي الريبي مجموع بولي-A المختارة ومجزأة كما هو ثم تحويل القالب template.The RNA الأولي في [كدنا] باستخدام الناسخ العكسي. من أجل تعيين النصوص الحمض النووي الريبي كامل طول، وذلك باستخدام سليمة، RNA غير المتدهورة لبناء مكتبة [كدنا] هو المهم. لبورتشكل التسلسل، يتم إضافة محول متواليات محددة لطرفي [كدنا]. بعد ذلك، في معظم الحالات، يتم تضخيم جزيئات [كدنا] بواسطة PCR والتسلسل بطريقة عالية الإنتاجية.
بعد التسلسل، الناتجة يقرأ يمكن الانحياز إلى الجينوم مرجعية وقاعدة بيانات Transcriptome على. عدد يقرأ تلك الخريطة إلى الجين إشارة يحسب ويمكن استخدام هذه المعلومات لتقدير مستوى التعبير الجيني. ويمكن أيضا أن يتم تجميعها من جديد دون الجينوم إشارة، مما يتيح دراسة transcriptomes في الكائنات غير نموذج 9 يقرأ. كما تم استخدام تقنية الحمض النووي الريبي وما يليها لكشف الإسوية لصق 10-12، 13 رواية النصوص واندماج الجين 14. بالإضافة إلى الكشف عن الجينات المكودة للبروتين، يمكن أن تسلسل الحمض النووي الريبي أيضا أن تستخدم لكشف وتحليل مستوى الرواية نسخ من الرنا غير الترميز، مثل فترة طويلة غير الترميز الحمض النووي الريبي 15،16، 17 الرنا الميكروي، سيرنا الخ 18. بسبب رانه دقة هذه الطريقة، وقد استخدم ذلك للكشف عن الاختلافات النووية المنفردة 19،20.
قبل ظهور التكنولوجيا-RNA بعدها، كان ميكروأري الوسيلة الرئيسية المستخدمة لتحليل التعبير الجيني الشخصي. ويتم تصنيعه تحقيقات المصممة مسبقا وتعلق بعد ذلك إلى سطح صلب لتشكيل شريحة ميكروأري 21. يتم استخراج مرنا وتحويلها إلى [كدنا]. أثناء عملية النسخ العكسي، يتم دمج النيوكليوتيدات fluorescently المسمى في [كدنا] ويمكن تهجين [كدنا] على الشرائح ميكروأري. شدة الإشارة التي تم جمعها من بقعة معينة تعتمد على كمية [كدنا] ملزم لجنة التحقيق بشكل خاص على تلك البقعة 21. بالمقارنة مع التكنولوجيا RNA يليها، ميكروأري لديه العديد من القيود. أولا، يعتمد ميكروأري على المعرفة الموجودة مسبقا من الشرح الجينات، في حين تكنولوجيا RNA بعدها قادرة على كشف النصوص رواية النسبي في مستوى الخلفية عالية، الأمر الذي يحد من استخدامها عند جنرال الكتريكمستوى التعبير شمال شرق منخفض. الى جانب ذلك، تكنولوجيا RNA يليها ديها أعلى بكثير من المدى الديناميكي الكشف (8000 مرات) 7، في حين، بسبب الخلفية وإشارات تشبع، دقة ميكروأري محدودة لكل من الجينات وأعرب عالية ومتواضع 7،22. أخيرا، تحقيقات ميكروأري تختلف في الكفاءة التهجين، والتي جعل نتائج أقل موثوقية عند مقارنة مستويات التعبير النسبية للمحاضر مختلفة في عينة واحدة 23. على الرغم من تسلسل الحمض النووي الريبي لديه العديد من المزايا أكثر من ميكروأري، وتحليل بياناتها معقد. وهذا هو أحد الأسباب أن العديد من الباحثين لا يزالون يستخدمون ميكروأري بدلا من تسلسل الحمض النووي الريبي. ويلزم أدوات المعلوماتية الحيوية المختلفة لمعالجة البيانات وتحليل الحمض النووي الريبي يليها 24.
من بين العديد من الجيل المقبل من التسلسل (خ ع) المنصات، 454، البورشيد، الصلبة وايون سيل هم الأكثر استخداما على نطاق واسع. وكان 454 أول منصة تجارية NGS. خلافا لغيرها من المنصات التسلسلطول مثل البورشيد ومتين، ويولد 454 منصة تعد قراءة (متوسط 700 قاعدة يقرأ) 25. يعد يقرأ بشكل أفضل لتوصيف الأولي transcriptiome ترجع الزيادة إلى ارتفاع كفاءة تجميع 25. العيب الرئيسي للمنصة 454 هو التكلفة العالية في megabase التسلسل. البورشيد والمنصات الصلبة توليد يقرأ مع زيادة أعداد وأطوال قصيرة. التكلفة لكل megabase من تسلسل هو أقل بكثير من 454 منصة. بسبب الأعداد الكبيرة من يقرأ قصيرة لالبورشيد والمنصات الصلبة، تحليل بيانات أكثر كثافة حسابيا من ذلك بكثير. سعر الصك والكواشف لتسلسل لمنصة ايون سيل أرخص ووقت أقصر تسلسل 25. ومع ذلك، فإن نسبة الخطأ والتكلفة لكل megabase من تسلسل وأعلى بالمقارنة مع البورشيد والمنصات الصلبة. المنصات المختلفة لها مزاياها وعيوبها، وتتطلب أساليب مختلفة لتحليل البيانات. جيش التحرير الشعبى الصينىtform يجب أن يتم اختياره على أساس التسلسل الغرض وتوافر التمويل.
في هذه الورقة، ونحن نأخذ منصة البورشيد RNA تسلسل كمثال. كنا خلية EML كنظام نموذج للتحقيق المنظمين الرئيسيين في EML خلية تجديد الذات والتمايز، وفرت طرق مفصلة ل-RNA يليها بناء مكتبة وتحليل البيانات لحساب مستوى التعبير والكشف عن نسخة الرواية. أظهرنا في نشر رسائلنا السابقة أن الدراسة وما يليها-RNA في EML نظام نموذجي 2، عندما يقترن اختبار وظيفي (على سبيل المثال shRNA ضربة قاضية) توفير نهج قوي في فهم الآلية الجزيئية للمراحل المبكرة من التمايز للدم، ويمكن أن تكون بمثابة نموذج لتحليل خلية تجديد الذات والتمايز بشكل عام.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transcriptome على الثدييات معقد جدا 34-38. التكنولوجيا-RNA يليها تلعب دورا متزايد الأهمية في دراسات تحليل Transcriptome على، كشف النصوص رواية واحدة النوكليوتيدات اكتشاف الاختلاف وما إلى ذلك لديه العديد من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب لتحليل…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JQW, SZ, SD and KC are supported by grant from the National Institutes of Health and the Staman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundation.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | BHK cell culture |
| Anti-Mouse CD34 FITC | eBioscience | 11-0341-81 | FACS sorting |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | eBioscience | 12-5981-81 | FACS sorting |
| APC Mouse Lineage Antibody Cocktail | BD Biosciences | 558074 | FACS sorting |
| BD FACSAria Cell Sorter | BD Biosciences | Special offer sysmtem | FACS sorting |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 75cm2 | Corning incorporated | 430641 | Cell culture |
| Corning™ Cell Culture Treated Flasks 25cm2 | Corning incorporated | 430639 | Cell culture |
| Deoxyribonuclease I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068-015 | Library preparation |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | BHK cell culture |
| DPBS | Gibco | 14190 | Cell culture |
| HI FBS | Invitrogen | 16140071 | BHK cell culture |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050-122 | EML cell culture |
| IMDM | HyClone | SH30228.02 | EML cell culture |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Cell culture |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Isolation of lineage negative cells |
| NanoVue Plus spectrophotometer | GE Healthcare | 28-9569-62 | Quality control |
| Thermo Scientific™ Napco™ 8000 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Scientific | 15-497-002 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | EML cell culture |
| TRIzol® Reagent | Invitrogen | 15596-018 | RNA exraction |
| TruSeq™ RNA Sample Prep Kit v2 -Set B (48rxn) | Illumina | RS-122-2002 | Library preparation |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939AA | Quality control |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | Cell culture |
| 0.45 µm Syringe Filters | Nalgene | 190-2545 | Cell culture |
Referências
- Chambers, S. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell aging: wrinkles in stem cell potential. Stem Cell Rev. 3, 201-211 (2007).
- Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS genetics. 8, (2012).
- Ye, Z. J., et al. Complex interactions in EML cell stimulation by stem cell factor and IL-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4882-4887 (2011).
- Tsai, S., Bartelmez, S., Sitnicka, E., Collins, S. Lymphohematopoietic progenitors immortalized by a retroviral vector harboring a dominant-negative retinoic acid receptor can recapitulate lymphoid, myeloid, and erythroid development. Genes Dev. 8, 2831-2841 (1994).
- Weiler, S. R., et al. D3: a gene induced during myeloid cell differentiation of Linlo c-Kit+ Sca-1(+) progenitor cells. Blood. 93, 527-536 (1999).
- Ye, Z. J., Kluger, Y., Lian, Z., Weissman, S. M. Two types of precursor cells in a multipotential hematopoietic cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18461-18466 (2005).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Chu, Y., Corey, D. R. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic acid therapeutics. 22, 271-274 (2012).
- Hornett, E. A., Wheat, C. W. Quantitative RNA-Seq analysis in non-model species: assessing transcriptome assemblies as a scaffold and the utility of evolutionary divergent genomic reference species. BMC genomics. 13, 361 (2012).
- Eswaran, J., et al. RNA sequencing of cancer reveals novel splicing alterations. Scientific reports. 3, 1689 (2013).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Dynamic transcriptomes during neural differentiation of human embryonic stem cells revealed by short, long, and paired-end sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5254-5259 (2010).
- Loraine, A. E., McCormick, S., Estrada, A., Patel, K., Qin, P. RNA-seq of Arabidopsis pollen uncovers novel transcription and alternative splicing. Plant physiology. 162, 1092-1109 (2013).
- Edgren, H., et al. Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing. Genome biology. 12, 6 (2011).
- Ilott, N. E., Ponting, C. P. Predicting long non-coding RNAs using RNA sequencing. Methods. 63, 50-59 (2013).
- Sun, L., et al. Prediction of novel long non-coding RNAs based on RNA-Seq data of mouse Klf1 knockout study. BMC bioinformatics. 13, 331 (2012).
- Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods in molecular biology. 822, 183-188 (2012).
- Bolduc, F., Hoareau, C., St-Pierre, P., Perreault, J. P. In-depth sequencing of the siRNAs associated with peach latent mosaic viroid infection. BMC molecular biology. 11, 16 (2010).
- Chepelev, I., Wei, G., Tang, Q., Zhao, K. Detection of single nucleotide variations in expressed exons of the human genome using RNA-Seq. Nucleic acids research. 37, 106 (2009).
- Djari, A., et al. Gene-based single nucleotide polymorphism discovery in bovine muscle using next-generation transcriptomic sequencing. BMC genomics. 14, 307 (2013).
- Murphy, D. Gene expression studies using microarrays: principles, problems, and prospects. Advances in physiology education. 26, 256-270 (2002).
- Chen, K., et al. RNA-seq characterization of spinal cord injury transcriptome in acute/subacute phases: a resource for understanding the pathology at the systems level. PLoS one. 8, 72567 (2013).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome research. 18, 1509-1517 (2008).
- Ramskold, D., Kavak, E., Sandberg, R. How to analyze gene expression using RNA-sequencing data. Methods in molecular biology. 802, 259-274 (2012).
- Glenn, T. C. Field guide to next-generation DNA sequencers. Mol Ecol Resour. 11, 759-769 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols. 7, 562-578 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology. 10, 25 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature. 28, 511-515 (2010).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology. 11, 106 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Cheranova, D., et al. RNA-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells. J Vis Exp. , (2013).
- Zhang, H. M., et al. AnimalTFDB: a comprehensive animal transcription factor database. Nucleic acids research. 40, 144-149 (2012).
- Wu, J. Q., et al. Systematic analysis of transcribed loci in ENCODE regions using RACE sequencing reveals extensive transcription in the human genome. Genome Biol. 9, 3 (2008).
- Wu, J. Q., et al. Large-scale RT-PCR recovery of full-length cDNA clones. Biotechniques. 36, 690-696 (2004).
- Wu, J. Q., Shteynberg, D., Arumugam, M., Gibbs, R. A., Brent, M. R. Identification of rat genes by TWINSCAN gene prediction, RT-PCR, and direct sequencing. Genome Res. 14, 665-671 (2004).
- Dewey, C., et al. Accurate identification of novel human genes through simultaneous gene prediction in human, mouse, and rat. Genome Res. 14, 661-664 (2004).
- Wu, J. . Characterize Mammalian Transcriptome Complexity. , (2011).
