מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em> Wnt5a</em> גורם ציסטות בכליות דג הזברה
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
עוברי דג הזברה (Danio rerio) היו בשימוש נרחב כמודל ללימוד פיתוח כליות ומחלת כליות פוליציסטיות. ישנם יתרונות רבים לשימוש דג הזברה כמודל חיה: את הכדאיות של חקר אינטראקציות גנטיות, את היכולת להשתמש בmorpholinos antisense (MO) למציאת חלבון, הזדמנות assay במהירות מספר גדול של עוברים, ואת הקלות של צפייה פנוטיפים איבר ב חיים זחלים 1. כִּליַת רֵאשִׁית היא הכליה הראשונה לפתח בבעלי חוליות ופונקציונלי בדג הזברה זחל 2. המבנה של דג הזברה כִּליַת רֵאשִׁית בהשוואה פשוט יחסית לmetanephros היונקים, הכליות שלישי ואחרונה להתפתח ביונקים. נפרון הוא יחידת העבודה של הכליות, עם כל כליה אנושית המכילה בין 500,000-1,000,000 nephrons 3,4 וכל כליה עכבר יש כ -13,000 nephrons 5, ולכן קשה להבחין מבנה נפרון יחיד in כליות אדם או לעכבר. יש דג הזברה רק שני nephrons, וכל נפרון דג הזברה מכיל את כל הרכיבים העיקריים נמצאים בglomerulus והצינוריות של עכברים ובני אדם 6 וסוגי תאים דומים מתמחים כליות. בהשוואה לדגמי חוליות אחרות כגון Xenopus, נפרון דג הזברה דומה יותר נפרון היונקים כי יש לו מערכת סגורה 7.
בשנים האחרונות, הגנום דג הזברה כבר רצף, המאפשר היכרות הרחבה של כלים גנטיים, מוטציה משאבים נרחבים, ואוספים של קווי כתב מהונדסים בדגמי דג הזברה. כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה הצורות בין 12-72 לאחר שעה ההפריה (hpf) וניתן דמיינו בקלות בעוברים השקופים. חלבון הגידול של וילם WT1 הוא גורם חיוני להתפתחות כליות. קווי דג הזברה מהונדסים מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן wt1b Tg (wt1b: GFP) להראות expre GFPssion ממוקם דווקא באזורי pronephric בעוברי דג הזברה, החל מ -17 hpf 8. Nephronophthisis (NPHP), מחלת כליות פיברוזיס אוטוזומלית רצסיבית, נגרמת על ידי מוטציות של גני NPHP 9. NPHP4 מציאה על ידי morpholino גרם היווצרות ציסטה בTg (wt1b: GFP). דגי 10 לכן, דג מהונדס זה הוא מודל מתאים להתבוננות מבני כליות והיווצרות ציסטה במהלך התפתחות כליות. חשוב לציין, את ההשפעה של מאפננים של פיתוח כליות ניתן ללמוד באמצעות זן זה בזמן ובאופן יעיל עבודה.
העיתון שלנו מתאר את השימוש בTg (wt1b: GFP) דגים כמודל לדמיין היווצרות ציסטה בכליות לאחר אפנון הגן. אנחנו השתמשנו נגד תחושה-אתר שחבור ההתחלה וMOS להפיל את גן wnt5a בדג זברה. Wnt5a הוא גליקופרוטאין מופרש הלא קנוניה של משפחת Wnt שממלא תפקיד חשוב בהתפתחות איברים ולאחר לידה סלולרית שוניםפונקציה 11. Wnt5a עובד דרך מסלולי Wnt הלא קנוניות, כוללים מסלול קוטבי תא מישוריים (PCP), שכבר נמצא לשחק תפקיד בחלוקת תא אוריינטציה במהלך התארכות צינורי כליות. Wnt5a מסדיר את המסלול / PCP Wnt על ידי יצירה מורכבת עם קולטן כמו טירוזין קינאז (ריק), אשר transduces איתות Wnt5a נוסף על ידי יצירה מורכבת עם חלבוני VANGL קוטביות תא מישוריים 2 (Vangl2), ובכך לקדם יציבות Vangl2 12. פגמים במסלול PCP יכולים לגרום לחלוקת תא אקראית ולגרום להיווצרות ציסטה בכליה. אנחנו השתמשנו Tg (wt1b: GFP) קו דג הזברה להתבונן היווצרות ציסטה בכליות הבאות מציאה wnt5a. Tg (wt1b: GFP) מודל דג הזברה מאפשר הדמיה חיה ותצפית בזמן של מבנה כליות. לאחר מציאה wnt5a, היווצרות ציסטה בכליות נמצאה מתחילה ב 24 hpf; בגיל 72 hpf, ניתן היו למצוא ציסטות בglomeruli וtubules הפרוקסימלי. שיטה זו יכולה לשמש גם ליםקרין גנים אחרים שעלולים לגרום להיווצרות ציסטה בכליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחלת כליות פוליציסטיות (PKD) היא אחד מהגורמים העיקריים למחלת כליות סופנית בבני אדם ומאופיין בהיווצרות מתקדמת ציסטה, הרחבת כליות, ופיתוח אבובית נורמלי 14. PKD אוטוזומלית הדומיננטי (ADPKD) הוא מחלה גנטית שבו מוטציה של שני PKD1, קידוד polycystin-1 (PC1), או PKD2, קידוד polycystin-2 (PC2), תוצא?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (DK093625 לLH, וDK069909 וDK047757 לJHL) ו( פרס הצטיינות I01BX000820 לJHL) VA. ברצוננו להודות לד"ר מיכאל חבילת וד"ר Jie הוא באוניברסיטת פנסילבניה דג הזברה Core למתן תמיכה חיונית.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
