Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун<em> Wnt5a</em> Причины кисты у рыбок данио почек
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
Данио рерио (Danio rerio) эмбрионы были широко используется в качестве модели для изучения развития почек и поликистоз почек. Есть много преимуществ в использовании данио в качестве животной модели: технико-экономическое изучения генетических взаимодействий, способность использовать антисмысловые Morpholinos (MO) для белка нокдаун, возможность быстро пробирной большое количество эмбрионов, и легкость просмотра органов фенотипы в жить личинки 1. Предпочка является первым почек развивать у позвоночных и функционально в личиночной рыбок данио 2. Структура данио предпочки относительно проста по сравнению с metanephros млекопитающих, третий и последний почек развивать у млекопитающих. Нефрона является рабочий блок почки, с каждой почки человека, содержащей от 3,4 500,000-1,000,000 нефронов и каждой мыши почки, имеющей приблизительно 13000 нефронов 5, что делает его трудно наблюдать единую структуру нефрона яN человека или мыши почки. Данио имеет только два нефронов, и каждый данио нефрона содержит все основные компоненты, найденные в клубочек и канальцев мышей и человека 6 и аналогичных специализированных видов почечных клеток. По сравнению с другими моделями позвоночных, таких как Xenopus, данио нефрона больше напоминает нефрона млекопитающего, поскольку она имеет закрытую систему 7.
В последние годы, данио геном был секвенирован, что позволяет обеспечить широкое введение генетических средств, обширные мутантных ресурсов и коллекций трансгенных репортерных линий в данио моделей. Данио предпочки формы между 12-72 ч после оплодотворения (ФВЧ) и могут быть легко визуализированы в прозрачных эмбрионов. Опухоль Белок Вильмса WT1 является существенным фактором для развития почек. Трансгенные линии, экспрессирующие данио зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем промотора в wt1b Tg (wt1b: GFP), показывают, GFP expreделения специально расположен в pronephric регионах у эмбрионов данио рерио, начиная с 17 часов после оплодотворения 8. Nephronophthisis (NPHP), аутосомно-рецессивный поликистоз почек, вызывается мутациями NPHP генов 9. NPHP4 нокдаун в морфолино- вызвало образование кисты в TG (wt1b: GFP). Рыбу 10 Таким образом, эта трансгенная рыба подходит модель для наблюдения структуры почек и образованию кист во время развития почек. Важно отметить, что влияние модуляторов развития почек могут быть изучены с использованием этого штамма в времени и труда эффективным образом.
Наша статья описывает использование ТГ (wt1b: GFP) рыбы в качестве модели для визуализации формирование почек кисты после генной модуляции. Мы использовали пуско-и сайту сплайсинга, анти-смысл МО, чтобы сбить ген Wnt5A у рыбок данио. Wnt5a является неканонической секретируется гликопротеин из семейства Wnt, который играет важную роль в развитии различных органов и послеродовой сотовойФункция 11. Wnt5a работает через неканонических Wnt путей, в том числе плоской клеточной полярности (PCP) пути, который был найден, чтобы играть важную роль в ориентированной клеточное деление в процессе почечных канальцев удлинения. Wnt5a регулирует Wnt / PCP путь, формируя комплекс с рецептором, как тирозинкиназы (Ryk), который дополнительно преобразовывает сигналы Wnt5a путем образования комплекса с плоской VANGL клеточной полярности белка 2 (Vangl2), тем самым способствуя стабильности Vangl2 12. Дефекты в PCP пути может привести к разделению случайной клеток и вызывать образование почечных кист. Мы использовали Tg (wt1b: GFP) данио линию наблюдать формирование почек кисты после Wnt5A нокдаун. Tg (wt1b: GFP) данио модель позволяет живого изображения и своевременной наблюдение структуры почек. После Wnt5A нокдаун, формирование почек киста была обнаружена, начиная с 24 часов после оплодотворения; в 72 часов после оплодотворения, кисты могут быть найдены в клубочках и проксимальных канальцах. Этот метод также может быть использован для SCreen другие гены, которые могут привести к образованию почек кисты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поликистоз почек (ДОК) является одним из ведущих причин терминальной стадии почечной болезни у людей и характеризуется образованием прогрессивной кисты, почечной расширения, и аномального развития канальцев 14. Аутосомно-доминантное PKD (ADPKD) является генетическим заболеванием, в …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH (DK093625 с ЛГ, и DK069909 и DK047757 в лдх) и VA (Merit Award I01BX000820 в лдх). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Майкла обновления и доктора Джи Не при Университете Пенсильвании, данио рерио Core, для обеспечения необходимой поддержки.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
Referências
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
